د ارسا مونوامایدونو کشف، ځانګړتیا او فعاله ښه والی د نوي نباتاتو د ودې مخنیوی کونکو په توګه چې د نباتاتو مایکروټیوبونه اغیزمن کوي.

د Nature.com د لیدلو لپاره مننه. د هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري. د غوره پایلو لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو د خپل براوزر نوې نسخه وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). په عین حال کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ د سټایل کولو یا جاواسکریپټ پرته ښیې.
د طبیعي محصولاتو کشف او ګټور کارول کولی شي د انسان ژوند ښه کولو کې مرسته وکړي. د نباتاتو د ودې مخنیوي کیمیاوي توکي په پراخه کچه د زیان رسوونکو واښو کنټرول لپاره د بوټو وژونکو په توګه کارول کیږي. د بوټو وژونکو مختلفو ډولونو کارولو اړتیا له امله، د عمل نوي میکانیزمونو سره مرکبات پیژندلو ته اړتیا ده. پدې څیړنه کې، موږ د Streptomyces werraensis MK493-CF1 څخه یو نوی N -alkoxypyrrole مرکب، coumamonamide کشف کړ او د بشپړ ترکیب پروسه یې رامینځته کړه. د بیولوژیکي فعالیت ارزونو له لارې، موږ وموندله چې urs-monoamic اسید د urs-monoamide مصنوعي منځګړیتوب دی او یو احتماليد نبات د ودې مخنیوی کوونکی. برسېره پردې، موږ د اوربینونیک اسید مختلف مشتقات رامینځته کړي دي، په شمول د اوربینیلوکسي مشتق (UDA)، کوم چې د HeLa حجرو وده باندې منفي اغیزه کولو پرته لوړ بوټي وژونکي فعالیت لري. موږ دا هم وموندله چې د اورموټونک اسید مشتقات د نبات مایکروټیوبونو ګډوډوي؛ سربیره پردې، KAND د ایکټین فلامینټونو اغیزه کوي او د حجرو مړینه هڅوي؛ دا څو اړخیز اغیزې د پیژندل شوي مایکروټیوبونو مخنیوی کونکو څخه توپیر لري او د اورسونیک اسید لپاره د عمل نوی میکانیزم وړاندیز کوي، کوم چې د نوي بوټو وژونکو په پراختیا کې یو مهم ګټه استازیتوب کوي.
د ګټورو طبیعي محصولاتو او د هغوی مشتقاتو کشف او عملي کارول د انسان د ژوند کیفیت ښه کولو لپاره یوه وسیله ده. د مایکرو ارګانیزمونو، نباتاتو او حشراتو لخوا تولید شوي ثانوي میټابولیتونه په طب او کرنه کې لوی پرمختګونه رامینځته کړي دي. ډیری انټي بیوټیکونه او د لیوکیمیا ضد درمل د طبیعي محصولاتو څخه رامینځته شوي دي. سربیره پردې، دآفت وژونکي، فنګس وژونکي او واښه وژونکي درمل د کرنې لپاره د کارولو لپاره له دې طبیعي محصولاتو څخه استخراج کیږي. په ځانګړي توګه، د زیان رسوونکو واښو کنټرول واښه وژونکي درمل په عصري کرنه کې د حاصلاتو د زیاتوالي لپاره مهم وسایل دي، او د مرکباتو مختلف ډولونه دمخه په سوداګریزه توګه کارول کیږي. په نباتاتو کې ډیری حجروي پروسې، لکه فوتوسنتز، امینو اسید میتابولیزم، د حجرو دیوال ترکیب، د مایتوسس تنظیم، د فایټو هورمون سیګنالینګ، یا د پروټین ترکیب، د واښه وژونکو ځانګړي هدفونه ګڼل کیږي. هغه مرکبات چې د مایکروټیوبیل فعالیت منع کوي د واښه وژونکو یو عام طبقه ده چې د مایتوټیک تنظیم 2 اغیزمن کولو سره د نبات وده اغیزه کوي.
مایکروټیوبونه د سایټوسکلیټون اجزا دي او په پراخه کچه په یوکاریوټیک حجرو کې ساتل کیږي. ټیوبلین هیټروډیمر د α-ټیوبلین او β-ټیوبلین څخه جوړ دی چې خطي مایکروټیوبیل پروټوفیلامینټونه جوړوي، د 13 پروټوفیلامینټونو سره چې سلنډر جوړښت جوړوي. مایکروټیوبونه د نباتاتو په حجرو کې ډیری رول لوبوي، پشمول د حجرو شکل ټاکل، د حجرو ویش، او د انټراسیلولر ټرانسپورټ 3,4. د نباتاتو حجرې د انټرفیز پلازما جھلی لاندې مایکروټیوبونه لري، او دا تش په نامه کورټیکل مایکروټیوبونه د سیلولوز ترکیب کمپلیکسونو تنظیم کولو له لارې د سیلولوز مایکرو فایبریلونو تنظیم کنټرولوي فکر کیږي 4,5. د ریښې ایپیډرمل حجرو کورټیکل مایکروټیوبونه، چې د ریښې د څوکې د چټک اوږدوالي په زون کې شتون لري، په اړخ کې موقعیت لري، او سیلولوز مایکرو فایبرونه دا مایکروټیوبونه تعقیبوي او د حجرو پراختیا لوري محدودوي، په دې توګه د انیسوټروپیک حجرو اوږدوالی هڅوي. له همدې امله، د مایکروټیوبیل فعالیت د نبات مورفولوژي سره نږدې تړاو لري. په جینونو کې د امینو اسید بدیلونه چې د ټیوبلین کوډ کوي د کورټیکل مایکروټیوبول صفونو د انحراف او په عربیډوپسیس 6,7 کې د کیڼ یا ښي اړخ ودې لامل کیږي. په ورته ډول، د مایکروټیوبول پورې اړوند پروټینونو کې بدلونونه چې د مایکروټیوبول متحرکات تنظیموي کولی شي د ریښو وده 8,9,10,11,12,13 ګډوډ کړي. سربیره پردې، د مایکروټیوبول ګډوډونکي بوټو وژونکو سره درملنه لکه ډیسوپیرامایډ، چې د پریټیلاکلور په نوم هم پیژندل کیږي، د کیڼ اړخ تریخ ریښې ودې لامل هم کیږي14. دا معلومات ښیي چې د مایکروټیوبول فعالیت دقیق تنظیم د نبات د ودې لوري ټاکلو لپاره خورا مهم دی.
د مایکروټیوبیل مخنیوی کونکو مختلف ډولونه کشف شوي، او دې درملو د سایټوسکلیټل څیړنې، او همدارنګه کرنې او طب کې د پام وړ مرسته کړې ده. په ځانګړي توګه، اوریزالین، ډینیټروانیلین مرکبات، ډیسوپیرامایډ، بینزامایډ پورې اړوند مرکبات، او د دوی انلاګونه کولی شي د مایکروټیوبیل فعالیت مخه ونیسي او په دې توګه د نبات وده منع کړي. له همدې امله، دوی په پراخه کچه د بوټو وژونکو په توګه کارول کیږي. په هرصورت، څرنګه چې مایکروټیوبیلونه د نباتاتو او څارویو حجرو یوه مهمه برخه ده، ډیری مایکروټیوبیل مخنیوی کونکي د دواړو حجرو ډولونو لپاره سایټوټوکسیک دي. له همدې امله، سره له دې چې د بوټو وژونکو په توګه د دوی پیژندل شوي ګټورتیا سره، د عملي موخو لپاره د انټي مایکروټیوبیل اجنټانو محدود شمیر کارول کیږي.
سټریپټومایس د سټریپټومایس کورنۍ یوه نسل ده، چې ایروبیک، ګرام مثبت، فلیمینټوس باکتریا پکې شامله ده او په پراخه کچه د ثانوي میټابولایټونو پراخه لړۍ تولیدولو وړتیا لپاره پیژندل کیږي. له همدې امله، دا د نوي بیولوژیکي فعال طبیعي محصولاتو یو له خورا مهمو سرچینو څخه ګڼل کیږي. په اوسني څیړنه کې، موږ د کومامونامایډ په نوم یو نوی مرکب کشف کړ، کوم چې د سټریپټومایس ویراینسس MK493-CF1 او S. ویراینسس ISP 5486 څخه جلا شوی و. د طیفي تحلیل او بشپړ طیفي تحلیل په کارولو سره، د کومامونامایډ جوړښت مشخص شو او د هغې ځانګړی N-alkoxypyrrole کنکال وټاکل شو. ترکیب. ارسمونیک اسید، د ارسمونوامایډ او د هغې مشتقاتو مصنوعي منځګړیتوب، د مشهور ماډل نبات عربیډوپسس تالیانا د ودې او ټوکیدنې مخنیوي لپاره وموندل شو. د جوړښت-فعالیت اړیکو مطالعې کې، موږ وموندله چې د C9 سره یو مرکب چې ارسونیک اسید ته بدل شوی، چې د ارسونیک اسید (KAND) د نانیلوکسي مشتق په نوم یادیږي، د ودې او ټوکیدنې په اړه د مخنیوي اغیزې ته د پام وړ وده ورکوي. د یادونې وړ ده چې د نبات د ودې نوی کشف شوی مخنیوی کوونکی د تنباکو او لیورورټ وده هم اغیزمنه کړې وه او د باکتریا یا HeLa حجرو لپاره سایټوټوکسیک نه وه. سربیره پردې، ځینې ارموټونک اسید مشتقات د ریښې تحریف شوی فینوټایپ رامینځته کوي، پدې معنی چې دا مشتقات په مستقیم یا غیر مستقیم ډول مایکروټیوبونو اغیزه کوي. د دې مفکورې سره سم، زموږ د مایکروټیوبونو مشاهدې چې یا د امیونوهیسټو کیمیکل یا فلوروسینټ پروټینونو سره لیبل شوي ښیي چې د KAND درملنه مایکروټیوبونه ډیپولیمرائز کوي. سربیره پردې، د کوماټونک اسید مشتقاتو سره درملنه د ایکټین مایکروفیلامینټونه ګډوډوي. پدې توګه، موږ د نبات د ودې یو نوی مخنیوی کوونکی کشف کړی چې د عمل ځانګړی میکانیزم یې د سایټوسکلیټن ویجاړول شامل دي.
د MK493-CF1 ډول د ټوکیو په شیناګاوا-کو کې له خاورې څخه جلا شو. د MK493-CF1 ډول ښه شاخ لرونکی سټرومل مایسیلیم جوړ کړ. د 16S ریبوسومل RNA جین (1422 bp) جزوي ترتیب ټاکل شوی و. دا ډول د S. werraensis سره ډیر ورته دی (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: عادي ډول، 99.93%). د دې پایلې پراساس، دا معلومه شوه چې دا ډول د S. werraensis ډول ډول سره نږدې تړاو لري. له همدې امله، موږ په موقتي ډول دا ډول S. werraensis MK493-CF1 نوم ورکړ. S. werraensis ISP 5486T هم ورته بایو فعال مرکبات تولیدوي. څرنګه چې د دې مایکرو ارګانیزم څخه د طبیعي محصولاتو ترلاسه کولو په اړه لږ لومړني څیړنې وې، نو نور کیمیاوي څیړنې ترسره شوې. د S. werraensis MK493-CF1 د وربشو په منځني کې د 30 درجو سانتي ګراد په تودوخه کې د 14 ورځو لپاره د جامد حالت تخمر له لارې د کښت کولو وروسته، منځني د 50٪ EtOH سره استخراج شو. د نمونې 60 ملی لیتر وچ شو ترڅو 59.5 ملی ګرامه خام استخراج ترلاسه کړي. خام استخراج د N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، نومول شوی coumamonamide، 36.0 mg) ورکولو لپاره د ریورس فیز HPLC تابع شو. د 1 ټول مقدار د خام استخراج نږدې 60٪ دی. له همدې امله، موږ پریکړه وکړه چې د کوماموټوامایډ 1 ځانګړتیاوې په تفصیل سره مطالعه کړو.
کومامونامایډ ۱ یو سپین بې شکله پوډر دی او د لوړ ریزولوشن ډله ایز سپیکٹرومیټري (HRESIMS) د C6H8N2O2 تاییدوي (شکل ۱). د دې مرکب د C2-بدلیدونکي پیروول ټوټه د δH 6.94 (1H، t، J = 2.8، 4.8 Hz، H-4)، δH 6.78 (1H، d، J = 2.5، δH په 1H NMR سپیکٹرم کې مشخص شوې ده: 4.5 Hz، H-5) او δH 6.78 (1H، d، J = 2.5 Hz، H-6)، او د 13C NMR سپیکٹرم د څلورو sp2 کاربن اتومونو شتون ښیې. د C2 موقعیت کې د امایډ ګروپ شتون د C-3 پروټون څخه امایډ کاربونیل کاربن ته د HMBC ارتباط لخوا په δC 161.1 کې ارزول شوی. برسېره پردې، د 1 H او 13 C NMR لوړوالی په δH 4.10 (3H, S) او δC 68.3 کې په مالیکول کې د N-میتوکسی ګروپونو شتون په ګوته کوي. که څه هم د میتوکسی ګروپ سم موقعیت لا تر اوسه د سپیکٹروسکوپي تحلیلونو لکه د لوړ شوي توپیر سپیکٹروسکوپي او نیوکلیر اوور هاوزر لنډیز (NOEDF) په کارولو سره نه و ټاکل شوی، N-میتوکسی-1H-پیرول-2-کاربوکسامایډ لومړی نوماند مرکب شو.
د ۱ د سم جوړښت د ټاکلو لپاره، یو بشپړ ترکیب ترسره شو (انځور ۲ الف). د m-CPBA سره د سوداګریزې پلوه شتون لرونکي ۲-امینوپیریډین ۲ درملنه د N-اکسایډ ۳ سره د مقداري حاصل په پایله کې وشوه. د ۲ د ۲-امینوازیدیشن وروسته، د ابراموویچ لخوا تشریح شوی سایکلوکانډینسیشن تعامل په بینزین کې په ۹۰ درجو سانتی ګراد کې ترسره شو ترڅو مطلوب ۱-هایډروکسی-۱H-پیرول-۲-کاربونیټریل ۵ په ګرامو کې ترلاسه کړي. سرعت ۶۰٪ (دوه مرحلې). ۱۵،۱۶. د ۴ میتیلیشن او هایدرولیسس بیا ۱-میتوکسی-۱H-پیرول-۲-کاربوکسیلیک اسید (چې "کوموټونک اسید" بلل کیږي، ۶) په ښه حاصل کې ورکړ (۷۰٪، دوه مرحلې). په پای کې، د اسید کلورایډ منځګړیتوب ۶ له لارې امایډیشن د اوبو امونیا په کارولو سره کوماموتو امایډ ۱ په ۹۸٪ حاصل کې ورکړ. د ترکیب شوي ۱ ټول طیفي معلومات جلا شوي ۱ ته ورته وو، نو د ۱ جوړښت ټاکل شوی و؛
د اوربینامایډ او اوربینیک اسید د بیولوژیکي فعالیت عمومي ترکیب او تحلیل. (الف) د کوماموتو امایډ ټول ترکیب. (ب) د اوو ورځو زاړه وحشي ډوله عربیډوپسیس کولمبیا (کولمبیا) تخمونه په موراشیج او سکوګ (MS) پلیټونو کې کرل شوي وو چې کومامونامایډ 6 یا کومامونامایډ 1 پکې په ښودل شوي غلظت کې وو. د پیمانه بار = 1 سانتي متره.
لومړی، موږ د urbenamide او د هغې د منځګړو بیولوژیکي فعالیتونه د نبات د ودې د تعدیل کولو وړتیا لپاره ارزولي دي. موږ د ursmonamide 1 یا ursmonic acid 6 مختلف غلظتونه د MS agar medium ته اضافه کړل او په دې medium کې د Arabidopsis thaliana تخمونه کرل شوي وو. دې ارزونو وښودله چې د 6 لوړ غلظت (500 μM) د ریښو وده منع کړه (انځور 2b). بیا، موږ د 6 د N1 موقعیت بدلولو سره مختلف مشتقات تولید کړل او په دوی باندې یې د جوړښت-فعالیت اړیکو مطالعات ترسره کړل (د انلاګ ترکیب پروسه په ملاتړي معلوماتو (SI) کې تشریح شوې). د Arabidopsis تخمونه په یوه منځګړیتوب کې کرل شوي وو چې 50 μM ursonic acid derivatives لري، او د ریښو اوږدوالی اندازه شوی و. لکه څنګه چې په انځور کې ښودل شوي. لکه څنګه چې په شکل 3a، b، او S1 کې ښودل شوي، کومامو اسیدونه د N1 موقعیت کې د خطي الکوکسي زنځیرونو (9، 10، 11، 12، او 13) یا لوی الکوکسي زنځیرونو (15، 16، او 17) مختلف اوږدوالی لري. مشتقاتو د ریښو د ودې د پام وړ مخنیوی ښودلی. سربیره پردې، موږ وموندله چې د 200 μM 10، 11، یا 17 تطبیق د ټوکیدنې مخه نیسي (انځورونه 3c او S2).
د کوماموتو امایډ او اړوندو مرکباتو د جوړښت او فعالیت اړیکې مطالعه. (الف) د انالوګونو جوړښت او ترکیب سکیم. (ب) د 7 ورځو زړو تخمونو د ریښو اوږدوالي اندازه کول چې په MS میډیم کې د 50 μM کومامونامایډ مشتقاتو سره یا پرته کرل کیږي. ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (t ازموینه، مخ< 0.05). n>۱۸. معلومات د اوسط ± SD په توګه ښودل شوي دي. nt معنی لري "نه ازمول شوي" ځکه چې له ۵۰٪ څخه ډیر تخمونه نه دي ټوکیدلي. (c) د درملنې شوي تخمونو د ټوکیدنې کچه اندازه کول چې د MS میډیم کې د ۲۰۰ μM کومامونامایډ او اړوند مرکباتو سره یا پرته د ۷ ورځو لپاره انکیوب شوي. ستوري د شرم درملنې (چی مربع ازموینه) سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي. n=۹۶.
په زړه پورې خبره دا ده چې د C9 څخه اوږد د الکیل اړخ زنځیرونو اضافه کول د مخنیوي فعالیت کم کړ، دا وړاندیز کوي چې د کوماموټیک اسید پورې اړوند مرکبات د دوی بیولوژیکي فعالیت ښودلو لپاره د یوې ټاکلې اندازې اړخ زنځیرونو ته اړتیا لري.
ځکه چې د جوړښت او فعالیت اړیکو تحلیل ښودلې چې C9 په ارسونیک اسید بدل شوی و او د ارسونیک اسید غیر ایلوکسی مشتق (چې له دې وروسته د KAND 11 په نوم یادیږي) د نبات د ودې ترټولو اغیزمن مخنیوی کونکی و، موږ د KAND 11 ډیر تفصیلي ځانګړتیا ترسره کړه. د 50 μM KAND 11 سره د عربیډوپسیس درملنه تقریبا په بشپړ ډول د ټوکیدنې مخه نیسي، پداسې حال کې چې د KAND 11 ټیټ غلظت (40، 30، 20، یا 10 μM) د ریښو وده په خوراک پورې تړلې طریقه منع کوي (انځور 4a، b). د دې ازموینې لپاره چې ایا KAND 11 د ریښو میرسټیم وړتیا اغیزه کوي، موږ د پروپیډیم آیوډایډ (PI) سره رنګ شوي ریښې میرسټیم معاینه کړل او د میرسټیم ساحې اندازه یې اندازه کړه. د هغو تخمونو د مریسټیم اندازه چې په یوه منځنی کې کرل شوي وو چې د 25 μM KAND-11 درلودونکی وو 151.1 ± 32.5 μm وه، پداسې حال کې چې د DMSO لرونکي کنټرول منځنی کې کرل شوي وو د مریسټیم اندازه 264.7 ± 30.8 μm وه (انځور 4c، d)، چې دا په ګوته کوي چې KAND-11 د حجروي فعالیت بیرته راګرځوي. خپریدل. د ریښې مریسټیم. د دې سره سم، د KAND 11 درملنې د ریښې مریسټیم کې د حجرو ویش مارکر CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS سیګنال اندازه کمه کړه (انځور 4e) 17. دا پایلې ښیي چې KAND 11 د حجرو د تکثیر فعالیت کمولو سره د ریښې وده منع کوي.
د ودې په اړه د urbenonic اسید مشتقاتو (urbenyloxy مشتقاتو) د مخنیوي اغیز تحلیل. (a) د 7 ورځو زاړه وحشي ډوله کولون تخمونه چې په MS پلیټونو کې د KAND 11 ښودل شوي غلظت سره کرل شوي. د پیمانه بار = 1 سانتي متره. (b) د ریښو اوږدوالی اندازه کول. حروف د پام وړ توپیرونه ښیې (Tukey HSD ازموینه، مخ< 0.05). n>۱۶. معلومات د اوسط ± SD په توګه ښودل شوي دي. (c) د پروپیډیم آیوډایډ رنګ شوي وحشي ډوله کولون ریښو کنفوکل مایکروسکوپي چې د MS پلیټونو کې د ۲۵ μM KAND سره یا پرته کرل شوي دي. ۱۱. سپینې قوسونه د ریښې مریسټیم ښیې. د پیمانه بار = ۱۰۰ µm. (d) د ریښې مریسټیم اندازې اندازه کول (n = ۱۰ څخه تر ۱۱ پورې). احصایوي توپیرونه د t-ټیسټ (p) په کارولو سره ټاکل شوي.< 0.05). بارونه د مریسټیم اوسط اندازه استازیتوب کوي. (e) د CDKB2 جوړښت لرونکي ریښې مریسټیم د توپیري مداخلې برعکس (DIC) مایکروسکوپي؛ 1pro: CDKB2؛ 1-GUS رنګ شوی او د 5 ورځو زاړه تخمونو باندې رنګ شوی چې د 25 µM KAND ازموینې سره یا پرته له MS پلیټونو کې کرل شوي.
د KAND 11 فایټوټوکسیسیټي د بل دوه اړخیزه بوټي، تمباکو (نیکوټیانا ټاباکم)، او د ځمکې د نباتاتو د ماډل یو لوی ارګانیزم، لیورورټ (مارچینتیا پولیمورفا) په کارولو سره نور هم ازمول شوې. لکه څنګه چې د عربیډوپسیس په قضیه کې، د تمباکو SR-1 تخمونه چې په 25 μM KAND 11 لرونکي منځني کې کرل شوي لنډې ریښې تولیدوي (انځور 5a). سربیره پردې، د 48 تخمونو څخه 40 په هغه پلیټونو کې ټوکیدلي چې 200 μM KAND 11 لري، پداسې حال کې چې ټول 48 تخمونه په جعلي درملنه شوي رسنیو کې ټوکیدلي، چې دا په ګوته کوي چې د KAND لوړ غلظت د پام وړ و (p< 0.05؛ chi test -square) د تنباکو د ټوکیدنې مخه ونیوله. (انځور 5b). سربیره پردې، د KAND 11 غلظت چې په لیورورټ کې د باکتریا وده منع کوي د عربیډوپسیس (انځور 5c) کې د اغیزمن غلظت سره ورته و. دا پایلې ښیي چې KAND 11 کولی شي د مختلفو نباتاتو وده منع کړي. بیا موږ په نورو ژوندی موجوداتو کې د ریچھ مونواماید پورې اړوند مرکباتو احتمالي سایټوټوکسیکیت وڅیړ، د بیلګې په توګه د انسان HeLa حجرو او Escherichia coli strain DH5α، د لوړ څارویو او باکتریا حجرو استازو په توګه، په ترتیب سره. د حجرو د تکثیر په یو لړ ازموینو کې، موږ ولیدل چې کومامونامایډ 1، کومامونامایډیک اسید 6، او KAND 11 د 100 μM غلظت کې د HeLa یا E. coli حجرو وده اغیزه نه کوي (انځور 5d،e).
د غیر عربیډوپسیس ژوندیو موجوداتو کې د KAND 11 د ودې مخنیوی. (a) د دوه اونیو زاړه وحشي ډول SR-1 تمباکو تخمونه په عمودي موقعیت لرونکي MS پلیټونو کې کرل شوي چې 25 μM KAND 11 لري. (b) د دوه اونیو زاړه وحشي ډول SR-1 تمباکو تخمونه په افقي موقعیت لرونکي MS پلیټونو کې کرل شوي چې 200 μM KAND 11 لري. (c) د دوه اونیو زاړه وحشي ډول Tak-1 لیورورټ غوټۍ چې په ګمبورګ B5 پلیټونو کې د KAND 11 ښودل شوي غلظت سره کرل شوي. سره تیرونه هغه تخمونه په ګوته کوي چې د دوه اونیو د انکیوبیشن دورې په جریان کې وده کول بند کړي. (d) د HeLa حجرو د حجرو د تکثیر ارزونه. د وړ حجرو شمیر د حجرو د شمیرنې کټ 8 (Dojindo) په کارولو سره په ټاکل شوي وخت وقفو کې اندازه شوی. د کنټرول په توګه، د HeLa حجرو د 5 μg/ml ایکټینومیسین D (Act D) سره درملنه وشوه، کوم چې د RNA پولیمیریز لیږد مخه نیسي او د حجرو د مړینې لامل کیږي. تحلیلونه په درې ګوني ډولونو کې ترسره شوي. (e) د E. coli حجرو تکثیر ارزونه. د ای کولی وده د OD600 اندازه کولو سره تحلیل شوه. د کنټرول په توګه، حجرو ته د 50 μg/ml امپیسیلین (Amp) سره درملنه وشوه، کوم چې د باکتریا د حجرو دیوال ترکیب مخنیوی کوي. تحلیلونه په درې ګوني ډول ترسره شول.
د یورامایډ پورې اړوند مرکباتو له امله د سایټوټوکسیسیټي د عمل میکانیزم د پوهیدو لپاره، موږ د یوربینیک اسید مشتقات د اعتدال مخنیوي اغیزو سره بیا تحلیل کړل. لکه څنګه چې په انځور کې ښودل شوي. لکه څنګه چې په انځور 2b، 6a کې ښودل شوي، د اګر پلیټونو کې کرل شوي تخمونه چې د یورموټونیک اسید 6 لوړ غلظت (200 μM) لري لنډ او کیڼ کږه ریښې تولیدوي (θ = – 23.7 ± 6.1)، پداسې حال کې چې د کنټرول میډیم کې کرل شوي تخمونه تقریبا مستقیم ریښې تولیدوي (θ = – 3.8 ± 7.1). دا ځانګړتیا لرونکی تریخ وده د کورټیکل مایکروټیوبلز 14,18 د خرابوالي له امله پیژندل کیږي. د دې موندنې سره سم، د مایکروټیوبیل بې ثباته کولو درملو ډیسوپیرامایډ او اوریزالین زموږ د ودې شرایطو لاندې ورته ریښې خښته کولو لامل شو (انځورونه 2b، 6a). په ورته وخت کې، موږ د اورموټونک اسید مشتقات ازموینه وکړه او ډیری یې غوره کړل چې په ځینو غلظتونو کې، د تریخ ریښې وده هڅوي. مرکبات ۸، ۹، او ۱۵ په ترتیب سره د ریښو د ودې لوري په ۷۵ μM، ۵۰ μM، او ۴۰ μM کې بدل کړل، چې دا په ګوته کوي چې دا مرکبات کولی شي په مؤثره توګه مایکروټیوبونه بې ثباته کړي (انځور ۲b، ۶a). موږ د یورسولیک اسید ترټولو قوي مشتق، KAND ۱۱، په ټیټ غلظت (۱۵ μM) کې هم ازموینه وکړه او وموندله چې د KAND ۱۱ کارول د ریښو وده منع کوي او د ریښو د ودې لوري غیر مساوي و، که څه هم دوی کیڼ اړخ ته میلان لري (شکل C3). ځکه چې د مایکروټیوبونو بې ثباته کولو درملو لوړ غلظت ځینې وختونه د ریښو د خښتو لامل کیدو پرځای د نبات وده منع کوي، موږ وروسته د دې احتمال ارزونه وکړه چې KAND ۱۱ د ریښو په اپیډرمل حجرو کې د کورټیکل مایکروټیوبونو په لیدلو سره مایکروټیوبونه اغیزمن کوي. د تخم د ریښو د ایپیډرمل حجرو کې د 25 μM KAND 11 سره درملنه شوي د انټي-β-ټیوبلین انټي باډیز په کارولو سره د معافیت کیمیا د اوږدوالي زون کې د ایپیډرمل حجرو کې نږدې ټولو کورټیکل مایکروټیوبونو ورکیدل ښیې (شکل 6b). دا پایلې ښیې چې کوماټونک اسید او د هغې مشتقات په مستقیم یا غیر مستقیم ډول په مایکروټیوبونو عمل کوي ترڅو دوی ګډوډ کړي او دا مرکبات نوي مایکروټیوبول مخنیوی کونکي دي.
ارسونیک اسید او د هغې مشتقات په عربیډوپسیس تالیانا کې د کورټیکل مایکروټیوبونو بدلوي. (الف) د ریښې د تمایل زاویه د مختلفو ارموټونک اسید مشتقاتو په شتون کې په ښودل شوي غلظت کې اندازه کیږي. د دوه مرکباتو اغیزې چې د مایکروټیوبونو مخنیوي لپاره پیژندل شوي: ډیسوپیرامایډ او اوریزالین هم تحلیل شوي. انسیټ هغه معیار ښیې چې د ریښې د ودې زاویه اندازه کولو لپاره کارول کیږي. ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (t ازموینه، p< 0.05). n>۱۹. د پیمانه بار = ۱ سانتي متره. (ب) د اوږدوالي زون کې د ایپیډرمل حجرو کې د کورټیکل مایکروټیوبونه. په وحشي ډوله عربیډوپسس کولون ریښو کې مایکروټیوبونه چې د MS پلیټونو کې د ۲۵ μM KAND ۱۱ سره یا پرته وده کوي د β-ټیوبلین لومړني انټي باډیز او الیکسا فلور-کنجوګیټډ ثانوي انټي باډیز په کارولو سره د امیونوهیسټو کیمیکل سټینینګ لخوا لیدل شوي. د پیمانه بار = ۱۰ µm. (ج) د ریښې مریسټیم کې د مایکروټیوبونو مایټوټیک جوړښت. مایکروټیوبونه د امیونوهیسټو کیمیکل سټینینګ په کارولو سره لیدل شوي. مایټوټیک جوړښتونه، پشمول د پروفیس زونونه، سپینډلونه، او فراګموپلاستونه، د کنفوکل عکسونو څخه شمیرل شوي. تیرونه د مایټوټیک مایکروټیوبونو جوړښتونه په ګوته کوي. ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه ښیې (t ازموینه، p< 0.05). n>۹. د پیمانه بار = ۵۰ µm.
که څه هم ارسا د مایکروټیوبیل فعالیت ګډوډولو وړتیا لري، تمه کیږي چې د عمل میکانیزم یې د عادي مایکروټیوبیل ډیپولیمرائز کولو اجنټانو څخه توپیر ولري. د مثال په توګه، د مایکروټیوبیل ډیپولیمرائز کولو اجنټانو لوړ غلظت لکه ډیسوپیرامایډ او اوریزالین د ایپیډرمل حجرو انیسوټروپیک پراختیا هڅوي، پداسې حال کې چې KAND 11 نه کوي. سربیره پردې، د KAND 11 او ډیسوپیرامایډ ګډ کارول د ډیسوپیرامایډ هڅول شوي ریښې ودې غبرګون او د KAND 11 هڅول شوي ودې مخنیوی پایله درلوده (شکل S4). موږ د KAND 11 ته د هایپر حساس ډیسوپیرامایډ 1-1 (phs1-1) میوټینټ غبرګون هم تحلیل کړ. phs1-1 د غیر کینونیکل ټیوبلین کایناس نقطه بدلون لري او لنډې ریښې تولیدوي کله چې د ډیسوپیرامایډ 9,20 سره درملنه وشي. phs1-1 میوټینټ تخمونه چې د اګر میډیم کې کرل شوي چې KAND 11 لري لنډې ریښې درلودې لکه د ډیسوپیرامایډ (شکل S5).
برسېره پردې، موږ د KAND 11 سره درملنه شوي تخمونو په ریښه میرسټیم کې د مایټوټیک مایکروټیوبیل جوړښتونه، لکه پروفیس زونونه، سپینډلونه، او فراګموپلاستونه ولیدل. د CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS لپاره د مشاهدو سره سم، د مایټوټیک مایکروټیوبیلونو په شمیر کې د پام وړ کمښت لیدل شوی (انځور .6c).
د KAND 11 د سایتوټوکسیکیت ځانګړتیا لپاره په فرعي حجروي ریزولوشن کې، موږ د تمباکو BY-2 تعلیق حجرو درملنه د KAND 11 سره وکړه او د دوی غبرګون مو ولید. موږ لومړی KAND 11 د BY-2 حجرو سره اضافه کړ چې TagRFP-TUA6 څرګندوي، کوم چې په فلوروسینټ ډول مایکروټیوبونه لیبل کوي، ترڅو د کورټیکل مایکروټیوبونو باندې د KAND 11 اغیز ارزونه وکړي. د کورټیکل مایکروټیوبونو کثافت د عکس تحلیل په کارولو سره ارزول شوی و، کوم چې د سایټوپلازمیک پکسلونو ترمنځ د سایټوسکیلیټل پکسلونو سلنه اندازه کوي. د ازموینې پایلو ښودلې چې د 1 ساعت لپاره د 50 μM یا 100 μM KAND 11 سره د درملنې وروسته، کثافت په ترتیب سره 0.94 ± 0.74٪ یا 0.23 ± 0.28٪ ته د پام وړ کم شو، پداسې حال کې چې د DMSO سره درملنه شوي حجرو کثافت 1.61 ± 0.34٪ ته رسیدلی (انځور 7a). دا پایلې د عربیډوپسیس په مشاهده کې د هغه مشاهدې سره مطابقت لري چې د KAND 11 درملنه د کورټیکل مایکروټیوبلز ډیپولیمرائزیشن هڅوي (شکل 6b). موږ د KAND 11 د ورته غلظت سره درملنې وروسته د GFP-ABD لیبل شوي ایکټین فلامینټونو سره د BY-2 لاین هم معاینه کړ او ولیدل چې د KAND 11 درملنه د ایکټین فلامینټونو ګډوډولو کې مرسته وکړه. د 1 ساعت لپاره د 50 μM یا 100 μM KAND 11 سره درملنه په ترتیب سره د ایکټین فلامینټونو کثافت 1.20 ± 0.62٪ یا 0.61 ± 0.26٪ ته د پام وړ کم کړ، پداسې حال کې چې د DMSO درملنې شوي حجرو کې کثافت 1.69 ± 0.51٪ و (شکل 2). 7b). دا پایلې د پروپیزامایډ اغیزو سره توپیر لري، کوم چې د ایکټین فلامینټونو اغیزه نه کوي، او لیټرونکولین B، یو ایکټین ډیپولیمرائزر چې مایکروټیوبلز اغیزه نه کوي (SI شکل S6). برسېره پردې، د کومامونامایډ ۱، کومامونامایډ اسید ۶، یا KAND ۱۱ سره درملنه د HeLa حجرو کې مایکروټیوبونو اغیزه نه کوي (SI شکل S7). په دې توګه، د KAND 11 د عمل میکانیزم د پیژندل شوي سایټوسکلیټون اختلال کونکو څخه توپیر لري. سربیره پردې، زموږ د BY-2 حجرو مایکروسکوپي مشاهدې د KAND 11 سره درملنه شوي د KAND 11 درملنې په جریان کې د حجرو د مړینې پیل څرګند کړ او وښودله چې د ایونز نیلي رنګ شوي مړو حجرو تناسب د KAND 11 درملنې 30 دقیقو وروسته د پام وړ نه دی زیات شوی، پداسې حال کې چې د 50 μM یا 100 μM KAND سره د 90 دقیقو درملنې وروسته، د مړو حجرو شمیر په ترتیب سره 43.7٪ یا 80.1٪ ته لوړ شو (انځور 7c). په ګډه اخیستل شوي، دا معلومات ښیي چې د نوي ursolic اسید مشتق KAND 11 د نبات ځانګړي سایټوسکلیټل مخنیوی کونکی دی چې د عمل دمخه نامعلوم میکانیزم لري.
KAND د کورټیکل مایکروټیوبلز، ایکټین فلامینټونو او د تمباکو BY-2 حجرو د ژوند وړتیا اغیزه کوي. (a) د TagRFP-TUA6 په شتون کې د BY-2 حجرو کې د کورټیکل مایکروټیوبلز لید. د KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO سره درملنه شوي BY-2 حجرې د کنفوکل مایکروسکوپي لخوا معاینه شوې. د کورټیکل مایکروټیوبلز کثافت د 25 خپلواکو حجرو مایکروګرافونو څخه محاسبه شوی. لیکونه د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (د ټوکی HSD ازموینه، p< 0.05). د پیمانه بار = 10 µm. (b) د BY-2 حجرو کې د کورټیکل ایکټین فلامینټونه چې د GFP-ABD2 په شتون کې لیدل شوي. د KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO سره درملنه شوي BY-2 حجرې د کنفوکل مایکروسکوپي لخوا معاینه شوې. د کورټیکل ایکټین فلامینټونو کثافت د 25 خپلواکو حجرو مایکروګرافونو څخه محاسبه شوی. لیکونه د پام وړ توپیرونه ښیې (د ټوکی HSD ازموینه، p< 0.05). د پیمانه بار = 10 µm. (c) د ایونز نیلي رنګ کولو لخوا د مړو BY-2 حجرو مشاهده. د KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO سره درملنه شوي BY-2 حجرې د روښانه ساحې مایکروسکوپي لخوا معاینه شوې. n = 3. د پیمانه بار = 100 µm.
د نویو طبیعي محصولاتو کشف او کارول د انسان د ژوند په مختلفو اړخونو کې د پام وړ پرمختګونه رامینځته کړي دي، په شمول د طب او کرنې. د طبیعي سرچینو څخه د ګټورو مرکباتو ترلاسه کولو لپاره تاریخي څیړنې ترسره شوي دي. په ځانګړي توګه، ایکټینومیسیټس د نیماتوډونو لپاره د پرازیتي ضد انټي بیوټیکونو په توګه ګټور پیژندل کیږي ځکه چې دوی د مختلفو ثانوي میټابولیتونو لکه ایورمیکټین، د ایورمیکټین او بلیومیسین مخکښ مرکب او د هغې مشتقات تولیدولو وړتیا لري، چې په طبي توګه د سرطان ضد اجنټ په توګه کارول کیږي21,22. په ورته ډول، د ایکټینومیسیټس څخه د بوټو وژونکو مرکباتو مختلف ډولونه کشف شوي، چې ځینې یې دمخه په سوداګریزه توګه کارول کیږي1,23. له همدې امله، د مطلوب بیولوژیکي فعالیتونو سره د طبیعي محصولاتو جلا کولو لپاره د ایکټینومیسیټ میټابولیتونو تحلیل یوه مؤثره ستراتیژي ګڼل کیږي. پدې څیړنه کې، موږ د ایس. ویراینسس څخه یو نوی مرکب، کومامونامایډ کشف کړ او په بریالیتوب سره یې ترکیب کړ. ارسونیک اسید د urbenamide او د هغې مشتقاتو مصنوعي منځګړیتوب دی. دا کولی شي د ځانګړتیا ریښې کرل کیدو لامل شي، د منځنۍ څخه تر قوي بوټو وژونکو فعالیت ښیې، او په مستقیم یا غیر مستقیم ډول د نبات مایکروټیوبونو ته زیان رسوي. په هرصورت، د اورموټونک اسید د عمل میکانیزم ممکن د موجوده مایکروټیوبول مخنیوی کونکو څخه توپیر ولري، ځکه چې KAND 11 د ایکټین فلامینټونه هم ګډوډوي او د حجرو د مړینې لامل کیږي، چې دا د تنظیمي میکانیزم وړاندیز کوي چې له مخې یې اورموټونک اسید او د هغې مشتقات د سایټوسکلیټل جوړښتونو پراخه لړۍ اغیزه کوي.
د اوربینونیک اسید نور تفصیلي ځانګړتیا به د اوربینونیک اسید د عمل میکانیزم په ښه پوهیدو کې مرسته وکړي. په ځانګړي توګه، راتلونکی هدف د اورسونیک اسید د وړتیا ارزونه ده چې د کم شوي مایکروټیوبونو سره وصل شي ترڅو معلومه شي چې ایا اورسونیک اسید او د هغې مشتقات په مستقیم ډول په مایکروټیوبونو عمل کوي او دوی ډیپولیمرائز کوي، یا ایا د دوی عمل د مایکروټیوبونو بې ثباتۍ لامل کیږي. سربیره پردې، په هغه حالت کې چې مایکروټیوبونه مستقیم هدف نه وي، د نباتاتو حجرو باندې د اورسونیک اسید د عمل ځای او مالیکولر اهداف پیژندل به د اړوندو مرکباتو ملکیتونو او د بوټو وژونکو فعالیت ښه کولو لپاره ممکنه لارو په پوهیدو کې مرسته وکړي. زموږ د بایو اکټیوټي ازموینې د نباتاتو لکه عربیډوپسیس تالیانا، تمباکو او لیورورټ په وده کې د اورسونیک اسید ځانګړې سایټوټوکسیک وړتیا څرګنده کړه، پداسې حال کې چې نه ای کولی او نه هم د هیلا حجرې اغیزمنې شوې. د څارویو حجرو ته لږ یا هیڅ زهرجنیت د اورسونیک اسید مشتقاتو ګټه ده که چیرې دوی په خلاصو کرنیزو ځمکو کې د کارولو لپاره د بوټو وژونکو په توګه رامینځته شي. په حقیقت کې، څرنګه چې مایکروټیوبونه په یوکاریوټونو کې عام جوړښتونه دي، په نباتاتو کې د دوی انتخابي مخنیوی د بوټو وژونکو لپاره کلیدي اړتیا ده. د مثال په توګه، پروپیزامایډ، د مایکروټیوبیل ډیپولیمرائز کولو اجنټ چې په مستقیم ډول ټیوبلین سره تړلی او د پولیمرائزیشن مخه نیسي، د څارویو حجرو ته د ټیټ زهریت له امله د بوټو وژونکي په توګه کارول کیږي24. د ډیسوپیرامایډ برعکس، اړوند بینزامایډونه مختلف هدف ځانګړتیاوې لري. د نباتاتو مایکروټیوبیلونو سربیره، RH-4032 یا بینزوکساماید هم په ترتیب سره د څارویو حجرو یا اوومیسیټس مایکروټیوبیلونه منع کوي، او زالیلامایډ د خپل ټیټ فایټوټوکسیکیت25,26,27 له امله د فنګس وژونکي په توګه کارول کیږي. نوي کشف شوي ریچھ او د هغې مشتقات د نباتاتو په وړاندې انتخابي سایټوټوکسیکیت ښیې، مګر دا د یادونې وړ ده چې نور تعدیلات ممکن د دوی د هدف ځانګړتیا بدله کړي، په بالقوه توګه د رنځجنیک فنګسي یا اوومیسیټس کنټرول لپاره اضافي مشتقات چمتو کوي.
د urbenonic اسید او د هغې مشتقاتو ځانګړي ملکیتونه د بوټو وژونکو په توګه د دوی د پراختیا او د څیړنې وسیلو په توګه د کارولو لپاره ګټور دي. د نباتاتو د حجرو شکل کنټرولولو کې د سایټوسکلیټون اهمیت په پراخه کچه پیژندل شوی. پخوانیو مطالعاتو ښودلې چې نباتات د مایکروټیوبیل متحرکاتو کنټرولولو سره د کورټیکل مایکروټیوبیل تنظیم پیچلي میکانیزمونه رامینځته کړي ترڅو د مورفوجینیسیس په سمه توګه کنټرول کړي. د مایکروټیوبیل فعالیت تنظیم کولو لپاره مسؤل مالیکولونو لوی شمیر پیژندل شوي، او اړوند څیړنې لاهم روانې دي 3,4,28. زموږ د نباتاتو په حجرو کې د مایکروټیوبیل متحرکاتو اوسنۍ پوهه د کورټیکل مایکروټیوبیل تنظیم میکانیزمونه په بشپړ ډول نه تشریح کوي. د مثال په توګه، که څه هم ډیسوپیرامایډ او اوریزالین دواړه کولی شي مایکروټیوبیلونه ډیپولیمرائز کړي، ډیسوپیرامایډ د ریښو شدید تحریف لامل کیږي پداسې حال کې چې اوریزالین نسبتا نرم اغیز لري. سربیره پردې، په ټیوبلین کې بدلونونه، کوم چې مایکروټیوبیلونه ثبات کوي، په ریښو کې د ډیکسټرروټیشن لامل هم کیږي، پداسې حال کې چې پیکلیټاکسیل، کوم چې د مایکروټیوبیل متحرکات هم ثبات کوي، نه کوي. له همدې امله، د ارسولیک اسید د مالیکولي اهدافو مطالعه او پیژندنه باید د نبات د کورټیکل مایکروټیوبونو تنظیم کولو په اړه نوي بصیرت چمتو کړي. په ورته ډول، د کیمیاوي موادو راتلونکي پرتله کول چې د تحریف شوي ودې هڅولو کې مؤثر دي، لکه ډیسوپیرامایډ، او لږ اغیزمن کیمیاوي توکي، لکه اوریزالین یا کوماموټریک اسید، به نښې چمتو کړي چې څنګه تحریف شوي وده رامینځته کیږي.
له بلې خوا، د دفاع پورې اړوند سایټوسکلیټل بیا تنظیم کول د ارسونیک اسید د سایټوټوکسیسیټي تشریح کولو لپاره یو بل امکان دی. د ناروغۍ انتان یا د نباتاتو حجرو ته د ایلیسیټر معرفي کول ځینې وختونه د سایټوسکلیټون ویجاړولو او وروسته د حجرو مړینې لامل کیږي 29. د مثال په توګه، د اوومیسیټ څخه اخیستل شوي کریپټوکسانتین راپور شوي چې د تمباکو حجرو مړینې دمخه مایکروټیوبلز او ایکټین فلامینټونه ګډوډوي، د KAND درملنې سره ورته ورته 30,31. د ارسونیک اسید لخوا رامینځته شوي د دفاعي غبرګونونو او حجروي غبرګونونو ترمنځ ورته والی موږ دې ته اړ ایستل چې فرضیه وکړو چې دوی عام حجروي پروسې رامینځته کوي، که څه هم د کریپټوکسانتین په پرتله د ارسونیک اسید ګړندی او قوي اغیز څرګند دی. په هرصورت، مطالعاتو ښودلې چې د ایکټین فلامینټونو ګډوډي د حجرو ناڅاپي مرګ ته وده ورکوي، کوم چې تل د مایکروټیوبلز ګډوډي سره نه وي 29. سربیره پردې، دا لیدل پاتې دي چې ایا یا رنځجن یا ایلیسیټر د ریښو د خرابې ودې لامل کیږي، لکه څنګه چې ارسونیک اسید مشتقات کوي. په دې توګه، د دفاعي غبرګونونو او سایټوسکلیټون سره نښلونکي مالیکولر پوهه یوه زړه راښکونکې ستونزه ده چې باید حل شي. د ارسونیک اسید پورې اړوند د ټیټ مالیکولي وزن مرکباتو شتون، او همدارنګه د مختلفو قوتونو سره د مشتقاتو لړۍ څخه په ګټې اخیستنې سره، دوی ممکن د نامعلوم حجروي میکانیزمونو په نښه کولو فرصتونه چمتو کړي.
په ګډه سره، د نویو مرکباتو کشف او کارول چې د مایکروټیوبیل متحرکات تنظیموي به د نبات د حجرو د شکل ټاکلو لاندې پیچلي مالیکولي میکانیزمونو ته د رسیدو لپاره قوي میتودونه چمتو کړي. پدې شرایطو کې، پدې وروستیو کې رامینځته شوی مرکب ارموټونک اسید، کوم چې مایکروټیوبیلونه او ایکټین فلامینټونه اغیزه کوي او د حجرو مړینه هڅوي، ممکن د مایکروټیوبیل کنټرول او د دې نورو میکانیزمونو ترمنځ د اړیکې د پوهیدو فرصت چمتو کړي. په دې توګه، د اوربینونیک اسید په کارولو سره کیمیاوي او بیولوژیکي تحلیل به موږ سره د مالیکولي تنظیمي میکانیزمونو په پوهیدو کې مرسته وکړي چې د نبات سایټوسکلیټون کنټرولوي.
د S. werraensis MK493-CF1 په یوه 500 ملی لیتره حیرانونکي ایرلینمایر فلاسک کې چې 110 ملی لیتره تخم لرونکی منځنی مواد لري چې 2٪ (w/v) ګالکټوز، 2٪ (w/v) ایسنس پیسټ، 1٪ (w/v) باکټو ترکیب لري، -سویټون (ترمو فشر ساینټیفیک، انکارپوریشن)، 0.5٪ (w/v) د جوارو استخراج (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan)، 0.2٪ (w/v) (NH4)2SO4 او 0.2٪ CaCO3 په ډیونیز شوي اوبو کې. (pH 7.4 د تعقیم کولو دمخه). د تخمونو کښتونه د 2 ورځو لپاره په 27 درجو سانتي ګراد کې په روټري شیکر (180 rpm) کې انکیوب شوي وو. د جامد حالت تخمر له لارې د تولید کښت. د تخم کلچر (۷ ملی لیتره) په ۵۰۰ ملی لیتره K-۱ فلاسک کې لیږدول شوی و چې ۴۰ ګرامه تولیدي وسیله پکې شامله وه چې ۱۵ ګرامه فشار شوي وربشې پکې شاملې وې (MUSO Co., Ltd., Japan) او ۲۵ ګرامه ډیونیز شوي اوبه (pH د تعقیم کولو دمخه تنظیم شوی نه و). تخمر د ۱۴ ورځو لپاره په تیاره کې په ۳۰ درجو سانتی ګراد کې ترسره شو. د تخمر مواد د ۴۰ ملی لیتره/بوتل EtOH سره استخراج او سینټرفیوج شوي (۱۵۰۰ ګرامه، ۴ درجو سانتی ګراد، ۱۰ دقیقې). د کلچر سوپرناټینټ (۶۰ ملی لیتره) د ۱۰٪ MeOH/EtOAc مخلوط سره استخراج شو. عضوي طبقه د کم فشار لاندې تبخیر شوه ترڅو پاتې شوني (59.5 ملی ګرامه) ترلاسه کړي، کوم چې د HPLC سره د تدریجي اخراج (0-10 دقیقې: 90٪) سره د ریورس فیز کالم (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120، 5 μm، ID 10 ملي میتر × اوږدوالی 250 ملي میتر) سره مخ شو. H2O/CH3CN، 10-35 دقیقې: 90٪ H2O/CH3CN څخه تر 70٪ H2O/CH3CN (تدریجي)، 35-45 دقیقې: 90٪ H2O/EtOH، 45-155 دقیقې: 90٪ H2O/EtOH څخه تر 100٪ EtOH (تدریجي (تدریجي)، 155-200 دقیقې: 100٪ EtOH) د 1.5 ملی لیتر/دقیقې جریان په کچه، کومامونامایډ (1، 36.0 ملی ګرامه) د سپینې بې شکله پوډر په توګه جلا شو.
کوماموتوامایډ (۱)؛ ۱H-NMR (۵۰۰ MHz، CDCl۳) δ ۶.۹۳ (t، J = ۲.۵ Hz، ۱H)، ۶.۷۶ (dd، J = ۴.۳، ۱.۸ Hz ۱H)، ۶.۰۵ (t، J = ۳.۸ Hz، ۱H).، ۴.۰۸ (s، ۳H)؛ ۱۳C-NMR (۱۲۵ MHz، CDCl۳) δ ۱۶۱.۱، ۱۲۱.۰، ۱۱۹.۹، ۱۱۲.۲، ۱۰۵.۰، ۶۸.۳؛ ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ محاسبه شوی ارزښت: 141.0659، اندازه شوی ارزښت: 141.0663، IR ν اعظمي 3451، 3414، 3173، 2938، 1603، 1593، 1537 سانتي متره–1.
د کولمبیا تخمونه (کول-0) د عربیډوپسیس بیولوژیکي سرچینو مرکز (ABRC) څخه د څیړنې کارولو لپاره د اجازې سره ترلاسه شوي. د کول-0 تخمونه زموږ د لابراتوار شرایطو لاندې تکثیر او ساتل شوي او د وحشي ډوله عربیډوپسیس بوټو په توګه کارول شوي. د عربیډوپسیس تخمونه په سطحه تعقیم شوي او په نیم ځواک موراشیج او سکوګ میډیم کې کرل شوي چې 2٪ سوکروز (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي)، 0.05٪ (w/v) 2-(4-مورفولینو) ایتان سلفونیک اسید (MES) (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي) لري. ) او 1.5٪ اګر (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي)، pH 5.7، په 23 °C او دوامداره رڼا کې. د phs1-1 میوټینټ تخمونه د T. Hashimoto (د ساینس او ​​ټیکنالوژۍ نارا انسټیټیوټ) لخوا چمتو شوي.
د SR-1 ډول تخمونه د T. Hashimoto (د نارا د ساینس او ​​ټیکنالوژۍ انسټیټیوټ) لخوا چمتو شوي او د وحشي ډوله تمباکو بوټو په توګه کارول شوي. د تنباکو تخمونه په سطحه تعقیم شوي او د دریو شپې لپاره په تعقیم اوبو کې ډوب شوي ترڅو ټوکیدنه وده وکړي، بیا په نیم ځواک محلول کې ځای په ځای شوي چې 2٪ سوکروز، 0.05٪ (w/v) MES، او 0.8٪ جیلان ګم (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي) موراشیګ او سکوګ میډیم) د pH 5.7 سره لري او په دوامداره رڼا کې په 23 درجو سانتي ګراد کې اچول شوي.
سټرین ټاک-۱ د ټي کوهچي (کیوټو پوهنتون) لخوا چمتو شوی و او د لیورورټ مطالعې لپاره د معیاري تجربوي واحد په توګه کارول شوی و. ګیما د تعقیم شوي کرل شوي بوټو څخه ترلاسه شوی و او بیا په ګمبورګ B5 میډیم (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي) کې پلیټ شوی و چې 1٪ سوکروز او 0.3٪ جیلان ګم لري او په دوامداره رڼا کې په 23 درجو سانتي ګراد کې اچول شوی و.
د تمباکو BY-2 حجرې (نیکوټیانا ټاباکم L. cv. روښانه ژیړ 2) د ایس. هاسیزاوا (د توکیو پوهنتون) لخوا چمتو شوي. BY-2 حجرې په تعدیل شوي لینزمیر او سکوګ میډیم کې 95 ځله حل شوې او په اونۍ کې د 2,4-ډایکلوروفینوکسایټیک اسید 32 سره ضمیمه شوې. د حجرو تعلیق په تیاره کې په 27 درجو سانتی ګراد کې په 130 rpm کې په روټري شیکر کې مخلوط شوی و. حجرې د تازه میډیم حجم 10 ځله سره ومینځئ او په ورته میډیم کې بیا ځړول. د BY-2 ټرانسجینک حجرې کرښې په ثابت ډول د مایکروټیوبیل مارکر TagRFP-TUA6 یا د اکټین فلیمینټ مارکر GFP-ABD2 د ګلابي موزیک ویروس 35S پروموټر لاندې څرګندوي لکه څنګه چې تشریح شوي 33,34,35 تولید شوي. دا حجرې کرښې د اصلي BY-2 سیل لاین لپاره کارول شوي ورته پروسیجرونو په کارولو سره ساتل کیدی شي او همغږي کیدی شي.
د HeLa حجرات د ډولبیکو په تعدیل شوي ایګل میډیم (DMEM) (Life Technologies) کې کرل شوي وو چې د جنین د غواګانو د سیرم 10٪، 1.2 U/ml پنسلین، او 1.2 μg/ml سټریپټومیسین سره په 37 درجو سانتی ګراد انکیوبیټر کې د 5٪ CO2 سره ضمیمه شوي وو.
ټولې هغه تجربې چې په دې لاسوند کې تشریح شوي د جاپان د بایو خوندیتوب مقرراتو او لارښوونو سره سم ترسره شوي.
مرکبات د ډایمیتیل سلفوکسایډ (DMSO؛ فوجی فلم واکو خالص کیمیاوي) کې د سټاک محلولونو په توګه حل شوي او د عربیډوپسیس او تمباکو لپاره په MS میډیم یا د لیورورټ لپاره ګمبورګ B5 میډیم کې حل شوي. د ریښې ودې مخنیوي ازموینې لپاره، په هر پلیټ کې له 10 څخه ډیر تخمونه په اګر میډیم کې کرل شوي چې اشاره شوي مرکبات یا DMSO لري. تخمونه د 7 ورځو لپاره د ودې په خونه کې اچول شوي. تخمونه عکس اخیستل شوي او د ریښو اوږدوالی اندازه شوی. د عربیډوپسیس د ټوکیدنې ازموینې لپاره، په هر پلیټ کې 48 تخمونه په اګر میډیم کې کرل شوي چې 200 μM مرکب یا DMSO لري. د عربیډوپسیس تخمونه د ودې په خونه کې کرل شوي او د ټوکیدنې شمیر د ټوکیدنې (ډیګ) څخه 7 ورځې وروسته شمیرل شوی. د تمباکو د ټوکیدنې ازموینې لپاره، په هر پلیټ کې 24 تخمونه په اګر میډیم کې کرل شوي چې 200 μM KAND یا DMSO لري. د تمباکو تخمونه د ودې په خونه کې کرل شوي او د ټوکیدنې شمیر د 14 ورځو وروسته شمیرل شوی. د لیورورټ د ودې د مخنیوي د ارزونې لپاره، د هر پلیټ څخه 9 جنینونه د اګر میډیم باندې پلیټ شوي وو چې د KAND یا DMSO ښودل شوي غلظت لري او د 14 ورځو لپاره د ودې په خونه کې ساتل شوي وو.
د ریښو د مریسټیم تنظیم لیدلو لپاره د 5 ملی ګرامه/ملی لیتر پروپیډیم آیوډایډ (PI) سره رنګ شوي تخمونه وکاروئ. د PI سیګنالونه د TCS SPE کنفوکال لیزر سکین کولو مایکروسکوپ (لیکا مایکروسیسټمز) په کارولو سره د فلوروسینس مایکروسکوپي لخوا لیدل شوي.
د ریښو هسټو کیمیکل رنګ کول د β-glucuronidase (GUS) سره د مالامي او بینفي لخوا تشریح شوي پروتوکول سره سم ترسره شول. تخمونه د شپې په 90٪ اسیټون کې تنظیم شوي، د 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic اسید سره د GUS بفر کې د 1 ساعت لپاره رنګ شوي او په هایډریټ شوي کلورالډیهایډ محلول کې ځای په ځای شوي. (8 g کلورال هایډریټ، 2 ملی لیتر اوبه او 1 ملی لیتر ګلیسیرول) او د اکسیو امیجر M1 مایکروسکوپ (کارل زیس) په کارولو سره د توپیري مداخلې برعکس مایکروسکوپي لخوا مشاهده شوي.
د ریښو زاویې د 7 ورځو زړو تخمونو په اړه اندازه شوې چې په عمودي ځای پر ځای شوي تختو کې کرل شوي. د ریښو زاویه د جاذبې ویکتور له لوري څخه اندازه کړئ لکه څنګه چې په 6 ګام کې تشریح شوي.
د کورټیکل مایکروټیوبلز ترتیب لکه څنګه چې تشریح شوی و، د پروتوکول 37 کې د کوچنیو بدلونونو سره مشاهده شو. د β-ټیوبلین ضد انټي باډي (KMX-1، Merk Millipore: MAB3408) او الیکسا فلور 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) په ترتیب سره د 1:1000 او 1:100 dilutions کې د لومړني او ثانوي انټي باډي په توګه کارول شوي. د فلوروسینس انځورونه د TCS SPE کنفوکال لیزر سکین کولو مایکروسکوپ (Leica Microsystems) په کارولو سره ترلاسه شوي. د Z-stack انځورونه ترلاسه کړئ او د جوړونکي لارښوونو سره سم د اعظمي شدت وړاندوینې رامینځته کړئ.
د HeLa حجرو د تکثیر ارزونه د تولیدونکي لارښوونو سره سم د حجرو شمېرنې کټ 8 (دوجینډو) په کارولو سره ترسره شوه.
د E. coli DH5α وده د 600 nm (OD600) په سپیکٹرو فوټومیټر کارولو سره په کلتور کې د حجرو کثافت اندازه کولو سره تحلیل شوه.
په ټرانسجینک BY-2 حجرو کې د سایټوسکیلیټل تنظیم د فلوروسینس مایکروسکوپ په کارولو سره لیدل شوی چې د CSU-X1 کنفوکال سکین کولو وسیله (یوکوګاوا) او د sCMOS کیمره (زیلا، انډور ټیکنالوژي) سره سمبال دی. د سایټوسکیلیټل کثافت د عکس تحلیل لخوا ارزول شوی، کوم چې د ImageJ سافټویر په کارولو سره د کنفوکال عکسونو کې د سایټوپلاسمیک پکسلونو ترمنځ د سایټوسکیلیټل پکسلونو سلنه اندازه کوي لکه څنګه چې تشریح شوي 38,39.
د BY-2 حجرو کې د حجرو د مړینې د کشفولو لپاره، د حجرو د تعلیق یوه برخه د خونې په تودوخه کې د 0.05٪ ایونز نیلي سره د 10 دقیقو لپاره انکیوبیټ شوه. د مړو حجرو انتخابي ایونز نیلي رنګ کول د سالم پلازما غشا لخوا د فعال حجرو څخه د رنګ په ایستلو پورې اړه لري40. رنګ شوي حجرې د روښانه ساحې مایکروسکوپ (BX53، اولمپس) په کارولو سره لیدل شوي.
د HeLa حجرات په DMEM کې وده شوي چې د 10٪ FBS سره په 37 درجو سانتی ګراد او 5٪ CO2 کې په رطوبت لرونکي انکیوبټر کې اضافه شوي. حجرات د 100 μM KAND 11، kumamonamic acid 6، kumamonamide 1، 100 ng/ml کولسیمید (Gibco)، یا 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) سره د 6 ساعتونو لپاره په 37 درجو سانتی ګراد کې درملنه شوي. حجرات د 10 دقیقو لپاره MetOH سره او بیا د خونې په تودوخه کې د 5 دقیقو لپاره د اسټیټ سره تنظیم شوي. ثابت حجرات د β-tubulin لومړني انټي باډي (1D4A4، Proteintech: 66240-1) سره د 0.5٪ BSA/PBS کې د 2 ساعتونو لپاره حل شوي، د TBST سره 3 ځله مینځل شوي، او بیا د الیکسا فلور وزې انټي باډي سره انکیوب شوي. 488 1 ساعت. - موږک IgG (ترمو فشر ساینسي: A11001) او 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) په 0.5٪ BSA/PBS کې حل شوي. د TBST سره درې ځله مینځلو وروسته، داغ شوي حجرې په نیکون ایکلیپس Ti-E التهاب مایکروسکوپ کې لیدل شوي. انځورونه د میټامورف سافټویر (مالیکولر وسایل) په کارولو سره د یخ شوي هاماماتسو ORCA-R2 CCD کیمرې سره اخیستل شوي.