د Nature.com لیدلو لپاره مننه.د براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري.د غوره پایلو لپاره، موږ وړاندیز کوو چې تاسو د خپل براوزر نوې نسخه وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ).په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ سایټ پرته له سټایل یا جاواسکریپټ ښودلو.
د طبیعي محصولاتو کشف او ګټه اخیستنه کولی شي د انسان ژوند ښه کولو کې مرسته وکړي.د نبات د ودې مخنیوی کیمیاوی مواد په پراخه کچه د زیان رسوونکو واښو کنټرول لپاره د بوټو وژونکو په توګه کارول کیږي.د مختلف ډوله بوټو وژونکو درملو کارولو اړتیا له امله ، د عمل نوي میکانیزمونو سره مرکبات پیژندلو ته اړتیا ده.په دې څیړنه کې، موږ د Streptomyces werraensis MK493-CF1 څخه یو ناول N -alkoxypyrrole مرکب، coumamonamide کشف کړ او د بشپړ ترکیب پروسه یې تاسیس کړه.د بیولوژیکي فعالیتونو د ارزونې له لارې، موږ وموندله چې urs-monoamic اسید د urs-monoamide یو مصنوعي منځګړیتوب دی او یو احتمال لريد نبات د ودې مخنیوی کونکی.برسېره پردې، موږ د urbenyloxy derivative (UDA) په ګډون مختلف urbenonic acid مشتقات رامینځته کړي، کوم چې د هیلا حجرو په وده منفي اغیزه کولو پرته د بوټو وژونکو لوړ فعالیت لري.موږ دا هم وموندله چې د urmotonic acid مشتقات د نبات مایکروټیوبیلونه ګډوډوي.برسېره پردې، KAND د ایکټین فلامینټونو اغیزه کوي او د حجرو مړینه هڅوي؛دا څو اړخیزې اغیزې د پیژندل شوي مایکروټیوبیل مخنیوی کونکو څخه توپیر لري او د ursonic اسید لپاره د عمل یو نوی میکانیزم وړاندیز کوي، کوم چې د نویو بوټو وژونکو په پراختیا کې یوه مهمه ګټه څرګندوي.
د ګټورو طبیعي محصولاتو کشف او عملي کارول او د دوی مشتقات د انسان د ژوند کیفیت ښه کولو وسیله ده.د مایکرو ارګانیزمونو، نباتاتو او حشراتو لخوا تولید شوي ثانوي میټابولیتونه د درملو او کرنې په برخه کې د لوی پرمختګ لامل شوي.ډیری انټي بیوټیکونه او د لیوکیمیا ضد درمل د طبیعي محصولاتو څخه رامینځته شوي.برسېره پردې، مختلف ډولونهآفت وژونکيفنګس وژونکي او واښه وژونکي د دې طبیعي محصولاتو څخه په کرنه کې د کارولو لپاره استخراج کیږي.په ځانګړې توګه، د زیان رسوونکو واښو کنټرول واښه وژونکي په عصري کرهنه کې د حاصلاتو د زیاتوالي لپاره مهم وسایل دي، او مختلف ډوله مرکبات دمخه په سوداګریزه توګه کارول کیږي.په نباتاتو کې ډیری سیلولر پروسې لکه فوتوسنتز، د امینو اسید میټابولیزم، د حجرو دیوال ترکیب، د مایتوسیس تنظیم، د فایټو هورمون سیګنالینګ، یا د پروټین ترکیب، د بوټو وژونکو ځانګړي هدفونه ګڼل کیږي.هغه مرکبات چې د مایکروټیوبیل فعالیت منع کوي د بوټو وژونکو عام طبقه ده چې د مایټوټیک مقرراتو په تاثیر کولو سره د نبات وده اغیزه کوي.
مایکروټیوبیلونه د سایټوسکلیټون برخې دي او په پراخه کچه په یوکریوټیک حجرو کې ساتل کیږي.ټیوبلین هیټروډیمر د α-tubulin او β-tubulin څخه جوړ دی چې خطي مایکروټیوبیل پروټوفیلمینټونه جوړوي، د 13 پروټوفیلمینټونو سره یو سلنډر جوړښت جوړوي.مایکروټیوبیلونه د نبات په حجرو کې ډیری رول لوبوي، په شمول د حجرو شکل، د حجرو ویش، او د انټرا سیلولر ټرانسپورټ 3,4.د نبات حجرې د انټرفیز پلازما جھلی لاندې مایکروټیوبیلونه لري، او دا تش په نامه کورټیکل مایکروټیوبیلونه فکر کیږي چې د سیلولوز مایکرو فایبریلونو تنظیم د سیلولوز سنتاز کمپلیکسونو تنظیم کولو له لارې کنټرولوي 4,5.د ریښو ایپیډرمل حجرو کورټیکل مایکروټیوبیلونه چې د ریښې د ګړندۍ اوږدوالي په زون کې شتون لري په ورو ورو موقعیت لري او د سیلولوز مایکرو فایبر دا مایکروټیوبونه تعقیبوي او د حجرو د توسعې سمت محدودوي چې په دې توګه د انیسوټروپیک حجرو اوږدوالی هڅوي.نو ځکه، د مایکروټیوبول فعالیت د نبات مورفولوژي سره نږدې تړاو لري.په جینونو کې د امینو اسید بدیلونه د ټیوبلین کوډ کولو سره د کورټیکل مایکروټیوبیل اریونو د سکیو او په عربیډوپسس 6,7 کې کیڼ یا ښي اړخ وده لامل کیږي.په ورته ډول، په مایکروټیوبیل پورې تړلي پروټینونو کې بدلونونه چې د مایکروټیوبول متحرکات تنظیموي هم کولی شي د ریښو مسخ شوي ودې لامل شي 8,9,10,11,12,13.برسېره پردې، د مایکروټیوبیل ګډوډولو بوټو وژونکو سره درملنه لکه ډیسوپایرامایډ، چې د پریټیلاکلور په نوم هم یادیږي، هم د کیڼ اړخ د ریښو د ودې لامل کیږي.دا معلومات په ګوته کوي چې د مایکروټیوبول فعالیت دقیق تنظیم د نبات د ودې سمت ټاکلو لپاره خورا مهم دی.
د مایکروټیوبیل مخنیوی کونکي بیلابیل ډولونه کشف شوي ، او دې درملو د سایټوسکیټل څیړنې ، او همدارنګه په کرنې او درملو کې د پام وړ مرسته کړې ده.په ځانګړې توګه، اوریزالین، ډینیتروانلین مرکبات، ډیسوپیرامایډ، بینزامایډ پورې اړوند مرکبات، او د دوی انلاګونه کولی شي د مایکروټیوبول فعالیت منع کړي او په دې توګه د نبات وده منع کړي.له همدې امله، دوی په پراخه کچه د بوټو وژونکو په توګه کارول کیږي.په هرصورت، څرنګه چې مایکروټیوبیلونه د نباتاتو او حیواني حجرو یوه مهمه برخه ده، ډیری مایکروټیوبیل مخنیوی کونکي د دواړو حجرو ډولونو ته سایټوټوکسیک دي.له همدې امله، سره له دې چې د بوټو وژونکو په توګه د دوی پیژندل شوي کارونې سره سره، یو محدود شمیر انټي مایکروټیوبیل اجنټ د عملي موخو لپاره کارول کیږي.
Streptomyces د Streptomyces د کورنۍ یوه جینس دی، چې په کې ایروبیک، ګرام مثبت، فلیمینټ باکتریا شامل دي او په پراخه کچه د ثانوي میټابولیتونو پراخه لړۍ تولیدولو وړتیا لپاره پیژندل کیږي.له همدې امله ، دا د نوي بیولوژیکي پلوه فعال طبیعي محصولاتو یو له خورا مهم سرچینو څخه شمیرل کیږي.په اوسنۍ څیړنه کې، موږ د coumamonamide په نوم یو نوی مرکب کشف کړ، کوم چې د Streptomyces werraensis MK493-CF1 او S. werraensis ISP 5486 څخه جلا شوی و. د سپیکٹرل تحلیل او بشپړ سپیکٹرل تحلیل په کارولو سره، د کومامونامایډ جوړښت مشخص شوی او د هغې بې ساري n-n. ټاکل شوې وه.ترکیبUrsmonic acid، د ursmonoamide او د هغې مشتق یو مصنوعي منځګړیتوب، وموندل شو چې د مشهور ماډل نبات Arabidopsis thaliana د ودې او ټوکیدنې مخنیوی کوي.د جوړښت-فعالیت اړیکو مطالعې کې، موږ وموندله چې د C9 سره یو مرکب چې په ursonic اسید کې بدلون موندلی، چې د ursonic acid (KAND) څخه د نونیلکسی مشتق په نوم یادیږي، د پام وړ په وده او نمو باندې مخنیوی اغیزه زیاتوي.د پام وړ، د نبات نوي کشف شوي د ودې مخنیوی هم د تنباکو او لیورورټ په وده اغیزه کوي او د باکتریا یا HeLa حجرو ته سایټټوکسیک نه و.برسېره پردې، ځینې urmotonic acid مشتقات د ریښې فانوټایپ تحریف کوي، دا په دې معنی چې دا مشتق په مستقیم یا غیر مستقیم ډول په مایکروټیوبونو اغیزه کوي.د دې مفکورې سره په مطابقت کې، زموږ د مایکروټیوبونو لیدونه چې یا د امونوهیسټو کیمیکل یا فلوروسینټ پروټینونو سره لیبل شوي دي دا په ګوته کوي چې د KAND درملنه د مایکروټیوبونو ډیپولیمریز کوي.برسېره پردې، د کماموتونیک اسید مشتقاتو سره درملنه د ایکټین مایکروفیلمینټونه ګډوډ کړي.په دې توګه، موږ د نبات د ودې یو نوی مخنیوی کشف کړ چې د عمل ځانګړی میکانیزم د سایتوسکلیټون ویجاړول شامل دي.
MK493-CF1 فشار د توکیو په شیناګاوا-کو کې له خاورې څخه جلا شوی و.MK493-CF1 فشار ښه ښاخ لرونکی سټرومل مایسیلیم جوړ کړی.د 16S ribosomal RNA جین (1422 bp) جزوی ترتیب ټاکل شوی و.دا فشار د S. werraensis سره ډیر ورته دی (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typical strain, 99.93%).د دې پایلې پر بنسټ، دا معلومه شوه چې دا فشار د S. werraensis ډول سره نږدې تړاو لري.له همدې امله، موږ په لنډمهاله توګه دې فشار ته S. werraensis MK493-CF1 نوم ورکړو.S. werraensis ISP 5486T هم ورته بایو فعال مرکبات تولیدوي.څرنګه چې د دې مایکرو ارګانیزم څخه د طبیعي محصولاتو ترلاسه کولو لپاره لږ ابتدايي څیړنې شتون درلود، نور کیمیاوي څیړنې ترسره شوې.د S. werraensis MK493-CF1 د وریجو په منځني ډول د 14 ورځو لپاره په 30 درجو سانتي ګراد کې د جامد حالت په واسطه د 14 ورځو لپاره د کرلو وروسته، منځنی د 50٪ EtOH سره استخراج شو.60 ملی ګرامه نمونه وچه شوه ترڅو 59.5 ملی ګرامه خام استخراج ترلاسه کړي.د خامو استخراج HPLC ته د N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1، coumamonamide په نوم نومول شوی، 36.0 mg) ورکولو لپاره د ریورس پړاو سره مخامخ شوی و.د 1 ټوله اندازه د خام استخراج نږدې 60٪ ده.له همدې امله، موږ پریکړه وکړه چې د kumamotoamide 1 ملکیتونه په تفصیل سره مطالعه کړو.
Coumamonamide 1 یو سپین امورفوس پوډر دی او د لوړ ریزولوشن ماس سپیکرومیټري (HRESIMS) تصدیق کوي C6H8N2O2 (انځور 1).د دې مرکب د C2-بدل شوي pyrrole ټوټه د δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4)، δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH په 1H NMR طیف کې: 4.5 Hz. ، H-5) او δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)، او د 13C NMR طیف د څلورو sp2 کاربن اتومونو شتون ښیي.د C2 موقعیت کې د امایډ ګروپ شتون په δC 161.1 کې د C-3 پروټون څخه امایډ کاربونیل کاربن ته د HMBC ارتباط لخوا ارزول شوی.برسېره پردې، د 1 H او 13 C NMR لوړوالی په δH 4.10 (3H, S) او δC 68.3 کې په مالیکول کې د N-methoxy ګروپونو شتون په ګوته کوي.که څه هم د میتوکسي ګروپ سم موقعیت لا تر اوسه د سپیکٹروسکوپي تحلیلونو په کارولو سره نه و ټاکل شوی لکه د لوړ شوي توپیر سپیکٹروسکوپي او اټومي اوور هاؤزر لنډیز (NOEDF)، N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide لومړی نوماند مرکب شو.
د 1 د سم جوړښت د ټاکلو لپاره، ټول ترکیب ترسره شو (انځور 2a).د m-CPBA سره په سوداګریزه توګه د موجود 2-aminopyridine 2 درملنه په پایله کې ورته N-oxide 3 په کمیتي حاصل کې.د 2 د 2-aminoazidation وروسته، د cyclocondensation عکس العمل چې د ابراموویچ لخوا تشریح شوی په بینزین کې په 90 ° C کې ترسره شو ترڅو مطلوب 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 په ګرام کې ترلاسه کړي.سرعت 60٪ (دوه مرحلې).۱۵،۱۶.د 4 میتیلیشن او هایدرولیسس بیا 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid ("cumotonic acid" په نوم یادیږي، 6) په ښه حاصل کې (70٪، دوه مرحلې) ورکړي.په نهایت کې، د تیزاب کلورایډ منځګړیتوب 6 له لارې د اوبو امونیا په کارولو سره د کوماموتو امایډ 1 په 98٪ کې حاصل ورکوي.د ترکیب شوي 1 ټول سپیکٹرل ډیټا جلا شوي 1 ته ورته وو، نو د 1 جوړښت ټاکل شوی و؛
د urbenamide او urbenic اسید د بیولوژیکي فعالیت عمومي ترکیب او تحلیل.(a) د کوماموتو امایډ ټول ترکیب.(b) اوه ورځنی وحشي ډوله Arabidopsis Columbia (Col) تخمونه په مراشیج او Skoog (MS) تختو کې کرل شوي چې په اشاره شوي غلظت کې coumamonamide 6 یا coumamonamide 1 لري.د پیمانه بار = 1 سانتي متره.
لومړی، موږ د urbenamide بیولوژیکي فعالیتونو ارزونه وکړه او د هغې منځګړیتوب د نبات د ودې د ترمیم کولو وړتیا لپاره.موږ د ursmonamide 1 یا ursmonic acid 6 مختلف غلظت د MS agar متوسط او د عربیډوپسس تالیانا کښت په دې متوسطه کې کرل شوي.دې ارزونو ښودلې چې د 6 لوړ غلظت (500 μM) د ریښو وده منع کوي (2b انځور).بیا، موږ د 6 د N1 موقعیت په ځای کولو سره مختلف مشتقات تولید کړل او په دوی باندې د جوړښت – فعالیت اړیکو مطالعات ترسره کړل (د انالوګ ترکیب پروسه د ملاتړ معلوماتو (SI) کې تشریح شوې).Arabidopsis تخمونه په منځني ډول کرل شوي چې د 50 μM ursonic acid مشتق لري، او د ریښو اوږدوالی اندازه شوی.لکه څنګه چې په انځور کې ښودل شوي.لکه څنګه چې په 3a، b، او S1 شکل کې ښودل شوي، د کومامو اسیدونه د N1 په موقعیت کې د خطي الکوکسي زنځیرونو مختلف اوږدوالی لري (9، 10، 11، 12، او 13) یا لوی الکوکسی زنځیرونه (15، 16، او 17).مشتق د ریښو د ودې د پام وړ مخنیوی ښودلی.برسېره پردې، موږ وموندله چې د 200 μM 10، 11، یا 17 د انعطاف مخه نیسي (انځر. 3c او S2).
د کوماموتو امایډ او اړوندو مرکباتو د جوړښت او فعالیت اړیکې مطالعه.(a) د انلاګونو جوړښت او ترکیب سکیم.(b) د ریښی اوږدوالی اندازه کول د 7-ورځو زاړه تخمونو اندازه چې په MS میډیم کې کرل شوي د 50 μM coumamonamide مشتقاتو سره یا پرته.ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (t test, p<0.05).n>18. ډاټا د اوسط ± SD په توګه ښودل شوي.nt معنی لري "نه ازمول شوي" ځکه چې له 50٪ څخه ډیر تخمونه ټوکیدلي ندي.(c) د درملنې شوي تخمونو د ټوکیدنې اندازې اندازه کول د 7 ورځو لپاره په MS میډیم کې د 200 μM کومامونامایډ او اړوندو مرکباتو سره یا پرته.ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (چی مربع ازموینه).n=96.
په زړه پورې خبره دا ده چې د C9 څخه اوږد د الکیل اړخ زنځیرونو اضافه کول د مخنیوي فعالیت کم کړی ، دا وړاندیز کوي چې د کوماموټویک اسید پورې اړوند مرکبات د خپل بیولوژیکي فعالیت ښودلو لپاره د یوې ټاکلې اندازې اړخ زنځیرونو ته اړتیا لري.
ځکه چې د جوړښت-فعالیت اړیکو تحلیل ښودلې چې C9 په ursonic اسید بدل شوی او د ursonic acid nonyloxy مشتق (چې وروسته د KAND 11 په نوم یادیږي) د نبات د ودې مخنیوی خورا اغیزمن و، موږ د KAND 11 نور تفصیلي ځانګړتیا ترسره کړه. د Arabidopsis درملنه. د 50 μM KAND 11 تقریبا په بشپړه توګه د ټوکیدنې مخه نیسي، پداسې حال کې چې د KAND 11 ټیټ غلظت (40, 30, 20، یا 10 μM) د خوراک پورې تړلي ډول د ریښو وده منع کوي (انځور 4a, b).د دې لپاره چې ایا KAND 11 د ریښو مرستیم وړتیا اغیزه کوي، موږ د ریښو مرستیمونه معاینه کړل چې د پروپیډیم آیوډیډ (PI) سره رنګ شوي او د میرستیم ساحې اندازه اندازه شوې.د 25 μM KAND-11 په مینځ کې د کرل شوي تخمونو د میرسټیم اندازه 151.1 ± 32.5 μm وه، پداسې حال کې چې د کنټرول میډیم کې د کرل شوي تخم اندازه DMSO 264.7 ± 30.8 μm (Figdm) وه. ، کوم چې دا په ګوته کوي چې KAND-11 د سیلولر فعالیت بحالوي.خپرېدلد ریښی مرستیم.د دې سره په مطابقت کې، د KAND 11 درملنې د حجرو ویش مارکر CDKB2؛ 1p:: CDKB2؛ 1-GUS سیګنال په ریښی مرستیم کې کم کړی (انځور 4e) 17.دا پایلې ښیي چې KAND 11 د حجرو د خپریدو فعالیت کمولو سره د ریښو وده منع کوي.
په وده باندې د urbenonic اسید مشتقاتو (urbenyloxy derivatives) د مخنیوي اغیزې تحلیل.(a) د 7-ورځو زوړ وحشي ډوله کولر تخمونه چې په MS پلیټونو کې کرل شوي د KAND 11 په نښه شوي غلظت سره. د سکیل بار = 1 سانتي متره.(b) د ریښو اوږدوالی اندازه کول.لیکونه د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (ټوکی HSD ازموینه، مخ<0.05).n>16. ډاټا د اوسط ± SD په توګه ښودل شوي.(c) د پروپیډیم آیوډیډ داغ لرونکي وحشي ډوله کولمو ریښو کنفوکل مایکروسکوپي چې په MS پلیټونو کې د 25 μM KAND سره یا پرته کرل کیږي 11. سپینې قوسونه د ریښو میرسټیم په ګوته کوي.سکیل بار = 100 µm.(d) د ریښو د میرسټیم اندازه اندازه کول (n = 10 څخه تر 11 پورې).احصایوي توپیرونه د t-test په کارولو سره ټاکل شوي (p<0.05).بارونه د منځنۍ مرستیم اندازې استازیتوب کوي.(e) د متفاوت مداخلې برعکس (DIC) د ریښې میرسټیم مایکروسکوپي چې د CDKB2 جوړښت لري؛1pro: CDKB2;1-GUS د 5-ورځو زړو تخمونو باندې داغ شوي او داغ شوي چې په MS پلیټونو کې د 25 µM KAND assay سره یا پرته کرل شوي.
د KAND 11 فایټوټوکسیت د بل ډیکوټیلیډونس نبات، تنباکو (نیکوټیانا ټاباکوم) او د ځمکې د نباتاتو یو لوی ماډل ارګانیزم، لیورورټ (مارچانتیا پولیمورفا) په کارولو سره نور هم ازمول شوی.لکه څنګه چې د Arabidopsis په قضیه کې، د تنباکو SR-1 تخمونه په متوسط ډول کرل شوي چې 25 μM KAND 11 لري لنډې ریښې تولیدوي (انځور 5a).برسیره پردې، د 48 تخمونو څخه 40 په پلیټونو کې چې د 200 μM KAND 11 درلودونکي دي، په داسې حال کې چې ټول 48 تخمونه په جعلي درملنه شوي رسنیو کې ټوکیدلي، دا په ګوته کوي چې د KAND لوړ غلظت د پام وړ و.< 0.05;chi test -square) د تنباکو د ټوکیدنې مخنیوی کوي.(انځور 5b).برسېره پردې، د KAND 11 غلظت چې په لیورورټ کې د باکتریا وده مخنیوی کوي په عربیډوپسس (انځور 5c) کې د اغیزمن غلظت سره ورته و.دا پایلې ښیي چې KAND 11 کولی شي د مختلفو نباتاتو وده منع کړي.موږ بیا په نورو ژوندی موجوداتو کې د ریښتو مونوامایډ پورې اړوند مرکبونو احتمالي سایټوټوکسیت تحقیق وکړ، د بیلګې په توګه د انسان HeLa حجرو او Escherichia coli strain DH5α، په ترتیب سره د لوړو حیواناتو او باکتریا حجرو استازو په توګه.د حجرو د خپریدو د ارزونو په لړۍ کې، موږ ولیدل چې کومامونامایډ 1، کومامونامیډیک اسید 6، او KAND 11 د 100 μM (انځور 5d،e) په غلظت کې د HeLa یا E. coli حجرو وده اغیزه نه کوي.
په غیر عربیډوپسس ارګانیزمونو کې د KAND 11 د ودې مخنیوی.(a) دوه اونۍ زاړه ځنګلي ډول SR-1 تنباکو تخمونه په عمودي موقعیت لرونکي MS پلیټونو کې کرل شوي چې 25 μM KAND 11 لري. MS پلیټونه چې 200 μM KAND 11 لري. (c) دوه اونۍ زاړه وحشي ډوله Tak-1 د لیورورټ جواني په ګمبور B5 پلیټونو کې د KAND 11 ښودل شوي غلظت سره کرل شوي. سور تیرونه هغه تخمونه په ګوته کوي چې د دوه اونیو انکیوبیشن کې وده کول بند کړي. موده(d) د HeLa حجرو د حجرو د خپریدو ارزونه.د وړ حجرو شمیر د حجرو شمیرنې کټ 8 (دوجنډو) په کارولو سره په ټاکلي وخت وقفو کې اندازه شوی.د کنټرول په توګه، د HeLa حجرې د 5 μg/ml actinomycin D (Act D) سره درملنه شوې، کوم چې د RNA پولیمیریز لیږد مخنیوی کوي او د حجرو د مړینې لامل کیږي.تحلیلونه په درې اړخیزه توګه ترسره شوي.(e) د ای کولی حجرو د خپریدو ارزونه.د E. coli وده د OD600 په اندازه کولو سره تحلیل شوه.د کنټرول په توګه، حجرې د 50 μg/ml ampicillin (Amp) سره درملنه شوې، کوم چې د باکتریا د حجرو دیوال ترکیب منع کوي.تحلیلونه په درې اړخیزه توګه ترسره شوي.
د یورامایډ پورې اړوند مرکباتو له امله رامینځته شوي سایټوټوکسیت د عمل میکانیزم درک کولو لپاره ، موږ د معتدل مخنیوي اغیزو سره د urbenic اسید مشتقات بیا تحلیل کړل.لکه څنګه چې په انځور کې ښودل شوي.لکه څنګه چې په 2b, 6a شکل کې ښودل شوي، هغه تخمونه چې د اګر په تختو کې کرل شوي د urmotonic اسید 6 لوړ غلظت (200 μM) لري لنډې او کیڼ اړخې منحني ریښې تولیدوي (θ = – 23.7 ± 6.1)، پداسې حال کې چې د کنټرول په منځ کې کرل شوي تخمونه. تخمونه تقریبا مستقیم ریښې تولیدوي (θ = – 3.8 ± 7.1).دا ځانګړنه ترویج وده د کورټیکل مایکروټیوبلیس 14,18 د ضعف په پایله کې پیژندل کیږي.د دې موندنو سره په مطابقت کې، د مایکروټیوبیل بې ثباته کونکي درمل ډیسوپایرامایډ او اوریزالین زموږ د ودې شرایطو لاندې ورته ورته ریښو ته وده ورکوي (انځر 2b، 6a).په ورته وخت کې، موږ د urmotonic acid مشتقات ازمویل او یو څو یې غوره کړل چې په ځانګړي غلظت کې، د ریښې ریښې وده هڅوي.مرکبات 8، 9، او 15 په ترتیب سره په 75 μM، 50 μM او 40 μM کې د ریښو د ودې لور ته بدلون ورکړ، دا په ګوته کوي چې دا مرکبات کولی شي په مؤثره توګه مایکروټیوبیلونه بې ثباته کړي (انځور 2b، 6a).موږ د خورا قوي ursolic اسید مشتق ، KAND 11 ، په ټیټ غلظت (15 µM) کې هم ازموینه وکړه او وموندله چې د KAND 11 پلي کول د ریښو وده منع کوي او دا چې د ریښو وده غیر مساوي وه ، که څه هم دوی چپ اړخ ته ځړول ( شکل C3)..ځکه چې د مایکروټیوبیل بې ثباته کولو درملو لوړ غلظت ځینې وختونه د نبات وده منع کوي د دې پرځای چې د ریښو خړوبیدو لامل شي ، موږ وروسته دا احتمال ارزولی چې KAND 11 د ریښو ایپیډرمل حجرو کې د کورټیکل مایکروټیوبونو په لیدو سره مایکروټیوبیلونه اغیزه کوي.د 25 μM KAND 11 سره درملنه شوي د تخم ریښو په ایپیډرمل حجرو کې د β-tubulin ضد انټي باډي په کارولو سره معافیتي کیمیا د اوږدوالي زون (انځور 6b) کې د ایپیډرمل حجرو کې نږدې ټول کورټیکل مایکروټیوبیلونه ورک شوي.دا پایلې ښیي چې کوماموټونک اسید او د هغې مشتقات په مستقیم یا غیر مستقیم ډول په مایکروټیوبونو باندې عمل کوي ترڅو دوی ګډوډ کړي او دا مرکبات نوي مایکروټیوبیل مخنیوی کونکي دي.
Ursonic اسید او د هغې مشتقات په Arabidopsis thaliana کې cortical microtubules بدلوي.(a) د ریښو د زاویې زاویه اندازه شوې چې د مختلف urmotonic اسید مشتقاتو په شتون کې په اشاره شوي غلظت کې.د دوه مرکباتو اغیزې چې د مایکروټیوبیلونو مخنیوي لپاره پیژندل شوي: ډیسوپیرامایډ او اوریزالین هم تحلیل شوي.انسیټ هغه معیار ښیي چې د ریښو د ودې زاویه اندازه کولو لپاره کارول کیږي.ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (t test, p<0.05).n>19. د پیمانه بار = 1 سانتي متره.(b) د اوږدوالي په زون کې د ایپیډرمل حجرو کې کورټیکل مایکروټیوبیلونه.په وحشي ډوله Arabidopsis Col ریښو کې مایکروټیوبیلونه چې په MS پلیټونو کې د 25 μM KAND 11 سره یا پرته کرل شوي د β-tubulin لومړني انټي باډیز او Alexa Fluor-conjugated ثانوي انټي باډي په کارولو سره د امونوهیسټو کیمیکل سټیننګ لخوا لیدل شوي.سکیل بار = 10 µm.(c) د ریښو په مرستیم کې د مایکروټیوبیلونو مایتوټیک جوړښت.مایکروټیوبیلونه د امونوهیسټو کیمیکل داغونو په کارولو سره لیدل شوي.د مایټوټیک جوړښتونه، په شمول د پروفیس زونونه، سپینډلز، او فرګموپلاستونه، د کنفوکل انځورونو څخه شمیرل شوي.تیر د مایټوټیک مایکروټیبول جوړښتونه په ګوته کوي.ستوري د شرم درملنې سره د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (t test, p<0.05).n>9. سکیل بار = 50 µm.
که څه هم Ursa د دې وړتیا لري چې د مایکروټیوبول فعالیت ګډوډ کړي، د دې د عمل میکانیزم تمه کیږي چې د مایکروټیوبول ډیپولیمیر کولو اجنټانو څخه توپیر ولري.د مثال په توګه، د مایکروټیوبول ډیپولیمر کولو اجنټانو لوړ غلظت لکه ډیسوپایرامایډ او اوریزالین د اپیډرمل حجرو انیسوټروپیک توسع رامینځته کوي پداسې حال کې چې KAND 11 نه کوي.برسېره پر دې، د KAND 11 او disopyramide د ګډ تطبیق په پایله کې د ګډ ډیسوپایرامایډ-حوصلې شوي ریښې وده غبرګون او د KAND 11 هڅول شوي ودې مخنیوی لیدل شوی (انځور S4).موږ همدارنګه د KAND 11 لپاره د hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant ځواب هم تحلیل کړ. phs1-1 غیر کینونیکي ټیوبلین کیناز پوائنټ میوټیشن لري او کله چې د disopyramide9,20 سره درملنه کیږي لنډې ریښې تولیدوي.phs1-1 متغیر تخمونه چې په اګر میډیم کې کرل شوي چې KAND 11 لري لنډې ریښې درلودې ورته ورته دي چې په ډیسپیرامید کې کرل شوي (انځر S5).
برسېره پردې، موږ د KAND 11 سره درملنه شوي تخمونو په ریښو کې د مایټوټیک مایکروټیوبیل جوړښتونه لکه د پروفیس زونونه، سپینډلز، او فرګموپلاستونه ولیدل. د مایټوټیک مایکروټیوبونو شمیر لیدل شوی (انځور .6c).
د فرعي سیلولر ریزولوشن کې د KAND 11 سایټوټوکسیت ځانګړتیا لپاره، موږ د KAND 11 سره د تمباکو BY-2 تعلیق حجرو درملنه وکړه او د دوی غبرګون یې مشاهده کړ.موږ لومړی KAND 11 د BY-2 حجرو ته اضافه کړ چې د TagRFP-TUA6 څرګندونه کوي، کوم چې په فلوروسینټ ډول مایکروټیوبونه لیبل کوي، ترڅو د کورټیکل مایکروټیوبونو باندې د KAND 11 اغیز ارزونه وکړي.د کورټیکل مایکروټیوبول کثافت د عکس تحلیل په کارولو سره ارزول شوی ، کوم چې د سایټوپلاسمیک پکسلز په مینځ کې د سایټوسکیلیټل پکسل سلنه اندازه کوي.د ارزونې پایلو ښودلې چې د 50 μM یا 100 μM KAND 11 سره د 1 ساعت لپاره د درملنې وروسته، کثافت په ترتیب سره 0.94 ± 0.74٪ یا 0.23 ± 0.28٪ ته راټیټ شو، پداسې حال کې چې د DMSO سره د درملنې شوي حجرو کثافت، 13 ± 13 ± 1.4 ته رسیږي. % (انځور 7a).دا پایلې د Arabidopsis له مشاهدې سره مطابقت لري چې د KAND 11 درملنه د کورټیکل مایکروټیوبونو ډیپولیمیریزیشن هڅوي (انځور 6b).موږ د BY-2 لاین د GFP-ABD-لیبل شوي ایکټین فیلامینټونو سره هم معاینه کړه وروسته له دې چې د KAND 11 ورته غلظت سره درملنه وشوه او ولیدل چې د KAND 11 درملنې د ایکټین فلامینټونه ګډوډ کړي.د 1 h لپاره د 50 μM یا 100 μM KAND 11 سره درملنه په ترتیب سره د actin filament کثافت په ترتیب سره 1.20 ± 0.62٪ یا 0.61 ± 0.26٪ ته راټیټوي، پداسې حال کې چې د DMSO درملنه شوي حجرو کې کثافت 1.69 %F21 ± 0.5 ± 0.20 % وو.7b).دا پایلې د پروپیزامایډ له اغیزو سره توپیر لري، کوم چې د ایکټین فلامینټونو اغیزه نه کوي، او latrunculin B، د ایکټین ډیپولیمرائزر چې مایکروټیوبیلونه اغیزه نه کوي (SI Figure S6).برسېره پردې، د کومامونامایډ 1، کومامونامایډ اسید 6، یا KAND 11 سره درملنه د HeLa حجرو کې مایکروټیوبونو باندې اغیزه نه کوي (SI Figure S7).په دې توګه، د KAND 11 د عمل میکانیزم داسې انګیرل کیږي چې د پیژندل شوي سایټوسکلیټون ګډوډونکو څخه توپیر لري.برسېره پردې، زموږ د BY-2 حجرو مایکروسکوپي مشاهده چې د KAND 11 سره درملنه شوې د KAND 11 درملنې په جریان کې د حجرو مړینې پیل په ګوته کوي او ښودلې چې د Evans نیلي رنګ شوي مړو حجرو تناسب د KAND 11 درملنې 30 دقیقې وروسته د پام وړ وده نه ده کړې، پداسې حال کې چې د 50 μM یا 100 μM کنډ سره د 90 دقیقو درملنې وروسته، د مړو حجرو شمیر په ترتیب سره 43.7٪ یا 80.1٪ ته لوړ شو (7c انځور).په ګډه اخیستل شوي، دا معلومات په ګوته کوي چې ناول ursolic acid derivative KAND 11 د نبات ځانګړي سایټوسکلیټ مخنیوی کونکی دی چې د عمل دمخه نامعلوم میکانیزم لري.
KAND د کورټیکل مایکروټیوبیلونه، ایکټین فلامینټونه، او د تنباکو BY-2 حجرو وړتیا اغیزه کوي.(a) د TagRFP-TUA6 په شتون کې د BY-2 حجرو کې د کورټیکل مایکروټیوبونو لید.BY-2 حجرې چې د KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO سره درملنه شوي د کنفوکال مایکروسکوپي لخوا معاینه شوي.د کورټیکل مایکروټیوبول کثافت د 25 خپلواکو حجرو مایکروګرافونو څخه محاسبه شوی.لیکونه د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (ټوکی HSD ازموینه، مخ<0.05).سکیل بار = 10 µm.(b) د BY-2 حجرو کې د Cortical actin filaments د GFP-ABD2 په شتون کې لیدل شوي.BY-2 حجرې چې د KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO سره درملنه شوي د کنفوکال مایکروسکوپي لخوا معاینه شوي.د کورټیکل ایکټین فلامینټونو کثافت د 25 خپلواکو حجرو مایکروګرافونو څخه محاسبه شوې.لیکونه د پام وړ توپیرونه په ګوته کوي (ټوکی HSD ازموینه، مخ<0.05).سکیل بار = 10 µm.(c) د Evans blue staining په واسطه د مړو BY-2 حجرو مشاهده.BY-2 حجرې چې د KAND 11 (50 μM یا 100 μM) یا DMSO سره درملنه شوي د روښانه ساحې مایکروسکوپي لخوا معاینه شوي.n=3.سکیل بار = 100 µm.
د نوي طبیعي محصولاتو کشف او پلي کول د درملو او کرنې په ګډون د انساني ژوند په بیلابیلو برخو کې د پام وړ پرمختګ لامل شوی.تاریخي څیړنې د طبیعي زیرمو څخه د ګټورو مرکباتو ترلاسه کولو لپاره ترسره شوي.په ځانګړې توګه، Actinomycetes د نیماتودونو لپاره د انټي پاراسټیک انټي بیوټیک په توګه پیژندل شوي ځکه چې د دوی وړتیا لري چې مختلف ثانوي میټابولیټ تولید کړي لکه avermectin، د ivermectin او bleomycin مخکښ مرکب او د هغې مشتق چې په درملو کې د سرطان ضد اجنټ په توګه کارول کیږي 21,22.په ورته ډول، یو ډول بوټي وژونکي مرکبات د actinomycetes څخه کشف شوي، چې ځینې یې دمخه په سوداګریزه توګه کارول کیږي 1,23.له همدې امله، د مطلوب بیولوژیکي فعالیتونو سره د طبیعي محصولاتو جلا کولو لپاره د ایکټینومیسیټ میټابولیټ تحلیل یوه مؤثره ستراتیژي ګڼل کیږي.په دې څیړنه کې، موږ د S. werraensis څخه یو نوی مرکب، coumamonamide کشف او په بریالیتوب سره یې ترکیب کړ.Ursonic اسید د urbenamide او د هغې مشتق یو مصنوعي منځګړیتوب دی.دا کولی شي د ریښو د کرینګ ځانګړتیا لامل شي، د اعتدال څخه تر قوي واښه وژونکي فعالیت څرګند کړي، او په مستقیم یا غیر مستقیم ډول د نبات مایکروټیوبونو ته زیان ورسوي.په هرصورت، د urmotonic اسید د عمل میکانیزم ممکن د موجوده مایکروټیوبیل مخنیوی کونکو څخه توپیر ولري، ځکه چې KAND 11 هم د ایکټین فلامینټونه ګډوډوي او د حجرو د مړینې لامل کیږي، یو تنظیمي میکانیزم وړاندیز کوي چې له مخې یې urmotonic اسید او د هغې مشتقات د سایټوسکلیټال جوړښتونو پراخه لړۍ اغیزه کوي..
د urbenonic اسید نور تفصیلي ځانګړتیا به د urbenonic اسید د عمل میکانیزم په ښه پوهیدو کې مرسته وکړي.په ځانګړې توګه، راتلونکی هدف دا دی چې د ursonic اسید د وړتیا ارزونه وکړي چې د کم مایکروټیوبونو سره تړل کیږي ترڅو معلومه کړي چې آیا ursonic اسید او د هغې مشتقات په مستقیم ډول په مایکروټیوبونو باندې عمل کوي او د دوی ډیپولیمیریز کوي، یا ایا د دوی عمل د مایکروټیوبیل بې ثباتۍ پایله لري.برسېره پردې، په هغه حالت کې چې مایکروټیوبیلونه مستقیم هدف نه وي، د نبات په حجرو کې د ursonic اسید د عمل ځای او مالیکولي اهدافو پیژندل به د اړوندو مرکباتو ملکیتونو او د بوټو وژونکو فعالیت ښه کولو احتمالي لارو په پوهیدو کې مرسته وکړي.زموږ د بیولوژیکي فعالیت ارزونې د نباتاتو په وده کې د ursonic اسید ځانګړی سایتټوکسیک وړتیا په ګوته کړه لکه Arabidopsis thaliana، تنباکو او لیورورټ، په داسې حال کې چې نه E. coli او نه د HeLa حجرې اغیزمن شوي.د څارویو حجرو ته لږ یا هیڅ زهرجن کول د ursonic اسید مشتقاتو ګټه ده که چیرې دوی په خلاص زراعتي ځمکو کې د کارولو لپاره د بوټو وژونکو په توګه رامینځته شي.په حقیقت کې، ځکه چې مایکروټیوبیلونه په یوکریټس کې عام جوړښتونه دي، په نباتاتو کې د دوی انتخابي مخنیوی د بوټو وژونکو لپاره کلیدي اړتیا ده.د مثال په توګه، پروپیزامایډ، یو مایکروټیوبیل ډیپولیمیریز ایجنټ چې په مستقیم ډول د ټیوبلین سره تړل کیږي او د پولیمیریزیشن مخنیوی کوي، د حیواني حجرو لپاره د ټیټ زهرجنیت له امله د بوټو وژونکو په توګه کارول کیږي.د ډیسوپایرامایډ په مقابل کې، اړونده بینزامایډ مختلف هدف ځانګړتیاوې لري.د نبات مایکروټیوبونو سربیره، RH-4032 یا بینزوکسامایډ په ترتیب سره د حیواني حجرو یا oomycetes مایکروټیوبیلونه هم مخنیوی کوي، او زلیلامایډ د 25,26,27 ټیټ فایټوټوکسیت له امله د فنګس وژونکي په توګه کارول کیږي.نوي کشف شوي ریچھ او د هغې مشتقات د نباتاتو په وړاندې انتخابي سایټوټوکسیکیت څرګندوي، مګر دا د یادولو وړ ده چې نور تعدیلات ممکن د دوی هدف مشخصیت بدل کړي، په بالقوه توګه د ناروغۍ فنګسي یا oomycetes کنټرول لپاره اضافي مشتقات چمتو کوي.
د urbenonic اسید ځانګړي ملکیتونه او د هغې مشتقات د بوټو وژونکو په توګه د دوی پراختیا لپاره ګټور دي او د څیړنې وسیلې په توګه کارول کیږي.د نبات د حجرو د شکل په کنټرول کې د سایټوسکلیټون اهمیت په پراخه کچه پیژندل شوی.پخوانیو څیړنو ښودلې چې نباتات د مایکروټیوبیل ډینامیکونو په کنټرولولو سره د کورټیکل مایکروټیوبیل تنظیم پیچلي میکانیزمونه رامینځته کړي ترڅو د مورفوګینسیس په سمه توګه کنټرول کړي.د مایکروټیوبیل فعالیت تنظیم کولو لپاره د مالیکولونو لوی شمیر پیژندل شوي، او اړوند څیړنې لاهم روانې دي 3,4,28.د نبات په حجرو کې د مایکروټیوبیل متحرکاتو په اړه زموږ اوسنۍ پوهه د کورټیکل مایکروټیوبیل تنظیم میکانیزمونه په بشپړ ډول نه تشریح کوي.د مثال په توګه، که څه هم دواړه ډیسوپایرامایډ او اوریزالین کولی شي مایکروټیوبیلونه ډیپولیمریز کړي، ډیسوپایرامایډ د ریښو د شدید تحریف لامل کیږي پداسې حال کې چې اوریزالین نسبتا معتدل تاثیر لري.برسېره پردې، په ټیوبلین کې تغیرات، چې مایکروټیوبیلونه ثبات کوي، په ریښو کې د ډیکسټروټریشن لامل کیږي، پداسې حال کې چې پالیټاکسیل، چې د مایکروټیوبیل متحرکات هم ثبات کوي، نه کوي.له همدې امله، د ursolic اسید د مالیکولر اهدافو مطالعه او پیژندنه باید د نبات کورټیکل مایکروټیوبونو تنظیم کولو نوي بصیرت چمتو کړي.په ورته ډول، د کیمیاوي موادو راتلونکي پرتله کول چې د تحریف شوي ودې په وده کې اغیزمن دي، لکه ډیسوپایرامایډ، او لږ اغیزمن کیمیاوي توکي، لکه اوریزالین یا کوماموټریک اسید، به دا نښې وړاندې کړي چې څنګه تحریف شوي وده رامنځته کیږي.
له بلې خوا، د دفاع پورې اړوند سایټوسکیلیټل بیا تنظیمات یو بل امکان دی چې د ursonic اسید سایټوټوکسیت تشریح کړي.د نبات په حجرو کې د رنځجن انتان یا د ایلیکټور معرفي کول ځینې وختونه د سایټوسکلیټون د ویجاړولو او وروسته د حجرو د مړینې لامل کیږي.د مثال په توګه، د oomycete څخه اخیستل شوي کریپټوکسانتین راپور شوي چې د تمباکو د حجرو له مړینې دمخه د مایکروټیوبونو او ایکټین فلامینټونو ګډوډولو لپاره، د KAND درملنې 30,31 سره ورته ورته ورته.د دفاعي غبرګونونو او سیلولر غبرګونونو ترمنځ ورته والی د ursonic اسید لخوا هڅول شوي موږ ته د دې لامل شوی چې فرضیه وکړو چې دوی د عام سیلولر پروسې رامینځته کوي، که څه هم د کریپټوکسانتین په پرتله د ursonic اسید چټک او قوي اغیز څرګند دی.په هرصورت، څیړنو ښودلې چې د ایکټین فلامینټونو ګډوډي د حجرو ناڅاپي مړینې ته وده ورکوي، کوم چې تل د مایکروټیوبیل ګډوډۍ سره نه وي.برسېره پر دې، دا باید وڅیړل شي چې آیا ناروغ یا ایلیکټور د ریښو د تحریف شوي ودې لامل کیږي، لکه څنګه چې د ursonic acid مشتقات کوي.په دې توګه، مالیکولر پوهه چې د دفاعي غبرګونونو او سایټوسکلیټون سره نښلوي یوه زړه پورې ستونزه ده چې باید په نښه شي.د ursonic اسید پورې اړوند د ټیټ مالیکولر وزن مرکباتو شتون څخه ګټه پورته کولو سره ، او همدارنګه د مختلف ځواک سره یو شمیر مشتقات ، دوی ممکن د نامعلوم سیلولر میکانیزمونو په نښه کولو فرصت چمتو کړي.
یوځای اخیستل، د نوي مرکبونو کشف او پلي کول چې د مایکروټیوبول ډینامیکونه تعدیل کوي به قوي میتودونه چمتو کړي ترڅو پیچلي مالیکول میکانیزمونه په نښه کړي چې د نبات د حجرو شکل ټاکلو لاندې دي.پدې شرایطو کې، پدې وروستیو کې رامینځته شوی مرکب urmotonic اسید، کوم چې مایکروټیوبیلونه او ایکټین فلامینټونه اغیزه کوي او د حجرو مړینه هڅوي، کیدای شي د مایکروټیوبول کنټرول او د دې نورو میکانیزمونو ترمنځ د ارتباط د تشریح کولو فرصت برابر کړي.په دې توګه، د urbenonic اسید په کارولو سره کیمیاوي او بیولوژیکي تحلیل به موږ سره د مالیکول تنظیمي میکانیزمونو په پوهیدو کې مرسته وکړي چې د نبات سایټوسکلیټون کنټرولوي.
د S. werraensis MK493-CF1 په یوه 500 ملی لیتر بفلډ ایرلینمایر فلاسک کې واچوئ چې 110 ملی لیتر د تخم متوسطه لري چې 2٪ (w/v) galactose، 2٪ (w/v) ایسنس پیسټ، 1٪ (w/v) باکټو ترکیب لري. .-سویټون (Thermo Fisher Scientific, Inc.)، 0.5% (w/v) د جوارو استخراج (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan)، 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 او 0.2% CaCO3 په deionized اوبو کې.(pH 7.4 مخکې له تعقیم کولو څخه).د تخم کلتورونه په روټري شیکر (180 rpm) کې د 27 درجې سانتي ګراد په درجه کې د 2 ورځو لپاره کیښودل شوي.د جامد حالت خمیر له لارې د تولید کښت.د تخم کلتور (7 ملی لیتر) په 500 ملی لیتر K-1 فلاسک کې لیږدول شوی چې 40 ګرامه د تولید منځنۍ برخه لري چې 15 ګرامه پریس شوي وربشې (MUSO Co., Ltd., Japan) او 25 g deionized اوبه (pH نه تنظیم شوي. د تعقیم کولو دمخه).).تخم کول د 14 ورځو لپاره په تیاره کې په 30 درجې سانتي ګراد کې ترسره کیږي.د خړوبولو مواد د 40 ملی لیتر / بوتل EtOH سره ایستل شوي او سینټرفیوج شوي (1500 ګرامه، 4 درجې C، 10 دقیقې).د کلتور سپرناټینټ (60 ملی لیتر) د 10٪ MeOH/EtOAc مخلوط سره استخراج شوی.عضوي طبقه د کم فشار لاندې تبخیر شوې وه ترڅو د پاتې شونو (59.5 mg) ترلاسه کړي، کوم چې د HPLC سره د تدریجي اخراج (0-10 دقیقې: 90٪) سره د بیرته پړاو کالم (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) تابع شوی. 10 mm × اوږدوالی 250 mm) H2O/CH3CN، 10-35 دقیقې: 90% H2O/CH3CN څخه تر 70% H2O/CH3CN (تدریج)، 35-45 دقیقې: 90% H2O/EtOH، 45-155 دقیقې: 90% H2 /EtOH تر 100٪ EtOH (تدریج (تدریج))، 155-200 دقیقې: 100٪ EtOH) د 1.5 ملی لیتر / دقیقې د جریان په اندازې کې، کومامونامایډ (1, 36.0 ملی ګرامه) د سپینې امورفوس پوډر په توګه جلا شوی.
Kumamotoamide (1)؛1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H)، 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H)., 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ حساب شوی ارزښت: 141.0659، اندازه شوی ارزښت: 141.0663، IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593–13cm.
د کولمبیا تخمونه (Col-0) د Arabidopsis بیولوژیکي سرچینو مرکز (ABRC) څخه د څیړنې کارولو اجازه سره ترلاسه شوي.د Col-0 تخمونه زموږ د لابراتوار شرایطو لاندې تکثیر شوي او ساتل شوي او د ځنګلي ډول عربیډوپسس بوټو په توګه کارول شوي.د Arabidopsis تخمونه په سطحه تعقیم شوي او په نیمه ځواک مراشیج او سکوګ متوسطه کې کرل شوي چې 2٪ سوکروز (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي)، 0.05٪ (w/v) 2- (4-مورفولینو) ایتانیسلفونیک اسید (MES) (فوجیفلم واکو پیور چیمیکل) ).) او 1.5٪ اګر (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي)، pH 5.7، په 23 ° C او دوامداره رڼا.د phs1-1 متغیر تخمونه د T. Hashimoto (نارا د ساینس او ټیکنالوژۍ انسټیټیوټ) لخوا چمتو شوي.
د تنباکو SR-1 تخمونه د T. Hashimoto (نارا د ساینس او ټیکنالوژۍ انسټیټیوټ) لخوا چمتو شوي او د ځنګلي ډول تمباکو بوټو په توګه کارول کیږي.د تنباکو تخمونه په سطحه تعقیم شوي او په جراثیمو اوبو کې د دریو شپې لپاره لمده شوي ترڅو د ټوکیدنې وده وکړي، بیا په نیم ځواک محلول کې چې 2٪ سوکروز، 0.05٪ (w/v) MES، او 0.8٪ جیلان ګم (فوجی فلم واکو خالص کیمیکل) لري کیښودل شوي. مراشېګ.او Skoog متوسط) د pH 5.7 سره او په دوامداره رڼا کې په 23 سانتي ګراد کې مینځل کیږي.
Strain Tak-1 د T. Kohchi (کیوټو پوهنتون) لخوا چمتو شوی او د لیورورټ مطالعې لپاره د معیاري تجربوي واحد په توګه کارول شوی.Gemma د تعقیم شوي کرل شوي بوټو څخه ترلاسه شوي او بیا په ګمبور B5 متوسطه (فوجیفلم واکو خالص کیمیاوي) کې 1٪ سوکروز او 0.3٪ جیلان ګم لري او په دوامداره رڼا کې په 23 درجې سانتي ګراد کې سینه شوي.
د تمباکو BY-2 حجرې (Nicotiana tabacum L. cv. روښانه ژیړ 2) د S. Hasezawa (د ټوکیو پوهنتون) لخوا چمتو شوي.د BY-2 حجرې په بدل شوي Linsmeier او Skoog متوسطه کې 95-fold کم شوي او په اونۍ کې د 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 سره ضمیمه شوي.د حجرې تعلیق په 130 rpm کې په 27 ° C په تیاره کې په روټري شیکر کې مخلوط شوی.حجرې د تازه منځني حجم 10 ځله سره وینځئ او په ورته متوسطه کې بیا پیل کړئ.د BY-2 ټرانجینک حجرې لاینونه په ثابت ډول د مایکروټیوبول مارکر TagRFP-TUA6 یا د ایکټین فلیمینټ مارکر GFP-ABD2 د ګلابي موزیک ویروس 35S پروموټر لاندې رامینځته شوي لکه څنګه چې تشریح شوي 33,34,35.دا حجرې لاینونه د اصلي BY-2 حجرو لاین لپاره کارول شوي ورته طرزالعملونو په کارولو سره ساتل کیدی شي او همغږي کیدی شي.
د HeLa حجرې د Dulbecco په تعدیل شوي Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) کې د 10% fetal bovine serum، 1.2 U/ml penicillin، او 1.2 μg/ml streptomycin سره په 37°C CO2 انکیوبیټر کې کرل شوي.
په دې نسخه کې تشریح شوي ټولې تجربې د جاپاني بایو خوندیتوب مقرراتو او لارښوونو سره سم ترسره شوې.
مرکبات په ډیمیتیل سلفوکسایډ (DMSO؛ Fujifilm Wako Pure کیمیکل) کې د سټاک محلولونو په توګه منحل شوي او د عربیډوپسس او تمباکو یا ګمبور B5 میډیم لپاره د لیورورټ لپاره په MS میډیم کې منحل شوي.د ریښو د ودې د مخنیوي ارزونې لپاره، په هر پلیټ کې له 10 څخه ډیر تخمونه په اګر میډیم کې کرل شوي چې اشاره شوي مرکبات یا DMSO لري.تخمونه د ودې په خونه کې د 7 ورځو لپاره کیښودل شوي.تخمونه عکس اخیستل شوي او د ریښو اوږدوالی اندازه شوی.د Arabidopsis ټوکیدنې ارزونې لپاره، په هر تخته کې 48 تخمونه په اګر میډیم کې کرل شوي چې 200 μM مرکب یا DMSO لري.د Arabidopsis تخمونه د ودې په خونه کې کرل شوي او د ټوکیدلو تخمونو شمیر د ټوکیدو څخه 7 ورځې وروسته شمیرل کیږي (داغ).د تنباکو د ټوکیدنې ارزونې لپاره، په هر تخته کې 24 تخمونه په اګر میډیم کې کرل شوي چې 200 μM KAND یا DMSO لري.د تنباکو تخمونه د ودې په خونه کې کرل شوي او د ټوکر شوي تخمونو شمیر د 14 ورځو وروسته شمیرل کیږي.د لیورورټ د ودې مخنیوی ارزونې لپاره، د هر پلیټ څخه 9 جنینونه په اګر میډیم کې پلي شوي چې د KAND یا DMSO ښودل شوي غلظت لري او د 14 ورځو لپاره د ودې په خونه کې ځای پرځای شوي.
د 5 mg/ml propidium iodide (PI) سره داغ شوي تخمونو څخه کار واخلئ ترڅو د ریښو مرستیم تنظیم وګورئ.د PI سیګنالونه د فلوروسینس مایکروسکوپي لخوا د TCS SPE کنفوکال لیزر سکینګ مایکروسکوپ (Leica Microsystems) په کارولو سره لیدل شوي.
د β-glucuronidase (GUS) سره د ریښو هسټو کیمیکل داغونه د مالامي او بینفی 36 لخوا تشریح شوي پروتوکول سره سم ترسره شوي.تخمونه د شپې په 90% acetone کې تثبیت شوي، د 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic اسید سره د 1 ساعت لپاره په GUS بفر کې داغ شوي او په هایډریټ کلورډیهایډ محلول کې کیښودل شوي.(8 g کلورال هایډریټ، 2 ملی لیتر اوبه او 1 ملی لیتر ګلیسیرول) او د Axio Imager M1 مایکروسکوپ (کارل زیس) په کارولو سره د توپیر مداخلې برعکس مایکروسکوپي لخوا لیدل کیږي.
د ریښو زاویه د 7 ورځو په زړو تخمونو اندازه شوي چې په عمودی تختو کې کرل شوي.لکه څنګه چې په 6 ګام کې تشریح شوي د جاذبې ویکتور له لوري څخه د ریښې زاویه اندازه کړئ.
د کورټیکل مایکروټیوبونو ترتیب لکه څنګه چې تشریح شوی لیدل شوی، په پروتوکول 37 کې د لږو بدلونونو سره.انټي β-ټیوبلین انټي باډي (KMX-1، مرک ملیپور: MAB3408) او Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) په 1:1000 او 1:100 کې د لومړني او ثانوي انټي باډي په توګه کارول شوي، په ترتیب سره.د فلوروسینس عکسونه د TCS SPE کنفوکال لیزر سکینګ مایکروسکوپ (Leica Microsystems) په کارولو سره ترلاسه شوي.د Z-stack عکسونه ترلاسه کړئ او د تولید کونکي لارښوونو سره سم د اعظمي شدت اټکلونه رامینځته کړئ.
د HeLa حجرو د خپریدو ارزونه د تولید کونکي لارښوونو سره سم د حجرو شمیرنې کټ 8 (دوجیندو) په کارولو سره ترسره شوې.
د E. coli DH5α وده په 600 nm (OD600) کې د سپیکٹرو فوټومیټر په کارولو سره په کلتور کې د حجرو کثافت اندازه کولو سره تحلیل شوې.
د ټرانسجینک BY-2 حجرو کې د سایټوسکلیټ تنظیم د فلوروسینس مایکروسکوپ په کارولو سره مشاهده شوی چې د CSU-X1 کنفوکال سکین کولو وسیله (یوکوګاوا) او د sCMOS کیمرې (Zyla, Andor Technology) سره مجهز شوی.د Cytoskeletal کثافت د عکس تحلیل لخوا ارزول شوی، کوم چې د 38,39 په توګه بیان شوي د ImageJ سافټویر په کارولو سره په کنفوکل انځورونو کې د سایتوپلاسمیک پکسلز په منځ کې د سایټوسکیلیټل پکسل فیصده اندازه کړې.
د BY-2 حجرو کې د حجرو مړینه کشف کولو لپاره، د حجرو د تعلیق یو الیکوټ د خونې په حرارت کې د 10 دقیقو لپاره د 0.05٪ ایون نیلي سره مینځل شوی و.د مړو حجرو انتخابي ایونز نیلي داغ د ثابت پلازما جھلی په واسطه د فعال حجرو څخه د رنګ په ایستلو پورې اړه لري.داغ شوي حجرې د روښانه ساحې مایکروسکوپ (BX53، Olympus) په کارولو سره لیدل شوي.
د HeLa حجرې په DMEM کې د 10% FBS سره ضمیمه شوي په رطوبت انکیوبیټر کې په 37°C او 5% CO2 کې وده کړې.حجرې د 100 μM KAND 11، kumamonamic acid 6، kumamonamide 1، 100 ng/ml colcemid (Gibco)، یا 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) سره د 6 h لپاره په 37 ° C کې درملنه شوې.حجرې د MetOH سره د 10 دقیقو لپاره او بیا د کوټې په حرارت کې د 5 دقیقو لپاره د Acetate سره تنظیم شوي.ثابتې حجرې د β-tubulin لومړني انټي باډي (1D4A4، Proteintech: 66240-1) سره په 0.5% BSA/PBS کې د 2 ساعتونو لپاره منحل شوي، 3 ځله په TBST سره مینځل شوي، او بیا د Alexa Fluor goat انټي باډي سره سینګار شوي.488 1 ساعت.- ماوس IgG (د ترمو فشر ساینسي: A11001) او 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) په 0.5% BSA/PBS کې ککړ شوي.د TBST سره د درې ځله مینځلو وروسته، داغ شوي حجرې د نیکون Eclipse Ti-E په بدل شوي مایکروسکوپ کې لیدل شوي.عکسونه د میټا مورف سافټویر (مالکولر وسیلو) په کارولو سره د یخ شوي هاماماتسو ORCA-R2 CCD کیمرې سره اخیستل شوي.
د پوسټ وخت: جون-17-2024