د ګیبریلین کمیتي بایوسینسر د شوټ اپیکل میرستیم کې د انټرنوډ مشخصاتو کې د ګیبریلین رول څرګندوي

د ډډ اپیکل میرستیم (SAM) وده د ډډ جوړښت لپاره خورا مهمه ده. د نباتاتو هورمونونهګیبریلین(GAs) د نباتاتو د ودې په همغږۍ کې کلیدي رول لوبوي، مګر په SAM کې د دوی رول په سمه توګه نه پوهیږي. دلته، موږ د DELLA پروټین انجینر کولو له لارې د GA سیګنال کولو تناسب میټریک بایوسینسر رامینځته کړ ترڅو د GA ټرانسکرپشنل غبرګون کې د هغې اړین تنظیمي فعالیت فشار کړي پداسې حال کې چې د GA پیژندلو پرمهال یې تخریب ساتي. موږ وښیو چې دا تخریب پر بنسټ بایوسینسر د پراختیا په جریان کې د GA کچې او سیلولر سینسنګ کې بدلونونه په سمه توګه ثبتوي. موږ دا بایوسینسر په SAM کې د GA سیګنال کولو فعالیت نقشه کولو لپاره کارولی. موږ وښیو چې د GA لوړ سیګنالونه په عمده توګه د عضوي پرائمورډیا ترمنځ موقعیت لرونکي حجرو کې شتون لري، کوم چې د انټرنوډ حجرو مخکیني دي. د ګټې او ضایع کیدو فعالیت طریقو په کارولو سره، موږ نور هم وښیو چې GA د حجرو ویش الوتکې سمت تنظیموي، د انټرنوډونو کینونیکي سیلولر تنظیم رامینځته کوي، په دې توګه په SAM کې د انټرنوډ مشخصاتو ته وده ورکوي.
د شوټ اپیکل مریسټیم (SAM)، چې د شوټ په سر کې موقعیت لري، د ډډ حجرو یو ځانګړی ځای لري چې فعالیت یې د نبات د ژوند په اوږدو کې په ماډلر او تکراري ډول د اړخي غړو او ډډ نوډونو تولیدوي. د دې تکراري واحدونو څخه هر یو، یا د نبات نوډونه، په نوډونو کې انټرنوډونه او اړخي غړي، او د پاڼو په محورونو کې اکسیلري مریسټیمونه شامل دي. د نبات د نوډونو وده او تنظیم د ودې په جریان کې بدلون مومي. په عربیډوپسیس کې، د انټرنوډ وده د نباتاتو په مرحله کې فشار کیږي، او اکسیلري مریسټیمونه د ګلاب پاڼو په محورونو کې غیر فعال پاتې کیږي. د ګل کولو مرحلې ته د لیږد په جریان کې، SAM د انفلاسیون مریسټیم کیږي، اوږد شوي انټرنوډونه او اکسیلري غوټۍ، د کاولین پاڼو په محورونو کې څانګې، او وروسته، بې پاڼې ګلونه تولیدوي. که څه هم موږ د هغو میکانیزمونو په پوهیدو کې د پام وړ پرمختګ کړی چې د پاڼو، ګلونو او څانګو پیل کنټرولوي، نسبتا لږ څه د دې په اړه پیژندل شوي چې څنګه انټرنوډونه رامینځته کیږي.
د GAs د spatiotemporal ویش پوهیدل به د دې هورمونونو دندو په مختلفو نسجونو او په مختلفو پرمختیایي مرحلو کې په ښه پوهیدو کې مرسته وکړي. د RGA-GFP فیوژن د تخریب لید چې د خپل پروموټر د عمل لاندې څرګند شوی د ریښو 15,16 کې د ټول GA کچو تنظیم کولو په اړه مهم معلومات چمتو کوي. په هرصورت، د RGA څرګندونه په نسجونو کې توپیر لري 17 او د GA18 لخوا تنظیم کیږي. پدې توګه، د RGA پروموټر توپیر څرګندونه ممکن د RGA-GFP سره مشاهده شوي فلوروسینس نمونې پایله ولري او پدې توګه دا طریقه کمیتي نه ده. په دې وروستیو کې، بایو اکټیو فلوروسین (Fl)-لیبل شوی GA19,20 د ریښې انډوکورټیکس کې د GA راټولیدل او د GA ټرانسپورټ لخوا د هغې د حجرو کچو تنظیم څرګند کړ. پدې وروستیو کې، د GA FRET سینسر nlsGPS1 وښودله چې د GA کچه په ریښو، فلامینټونو، او تیاره وده شوي هایپوکوټیلونو کې د حجرو اوږدوالي سره تړاو لري21. په هرصورت، لکه څنګه چې موږ لیدلي، د GA غلظت یوازینی پیرامیټر ندی چې د GA سیګنال کولو فعالیت کنټرولوي، ځکه چې دا د پیچلو سینس کولو پروسو پورې اړه لري. دلته، د DELLA او GA سیګنال کولو لارو په اړه زموږ د پوهې پر بنسټ، موږ د GA سیګنال کولو لپاره د تخریب پر بنسټ تناسب میټریک بایوسینسر پراختیا او ځانګړتیا راپور ورکوو. د دې کمیتي بایوسینسر د پراختیا لپاره، موږ د یو متغیر GA حساس RGA څخه کار واخیست چې د فلوروسینټ پروټین سره یوځای شوی و او په نسجونو کې په هر ځای کې څرګند شوی و، او همدارنګه د GA غیر حساس فلوروسینټ پروټین. موږ ښیې چې د متغیر RGA پروټین فیوژنونه د انډوجینس GA سیګنال کولو سره مداخله نه کوي کله چې په هر ځای کې څرګند شي، او دا بایوسینسر کولی شي د لوړ سپیټیوټیمپورل ریزولوشن سره د سینسنګ اپریټس لخوا د GA ان پټ او GA سیګنال پروسس کولو څخه رامینځته شوي سیګنال کولو فعالیت اندازه کړي. موږ دا بایوسینسر د GA سیګنال کولو فعالیت د سپیټیوټیمپورل ویش نقشه کولو لپاره کارولی او دا اندازه کوو چې GA څنګه په SAM ایپیډرمیس کې د سیلولر چلند تنظیموي. موږ دا ښیې چې GA د عضوي پریمورډیا ترمنځ موقعیت لرونکي SAM حجرو د ویش الوتکې سمت تنظیموي، په دې توګه د انټرنوډ کینونیکي سیلولر سازمان تعریفوي.
په پای کې، موږ وپوښتل چې ایا qmRGA کولی شي د ودې هایپوکوټیلونو په کارولو سره د داخلي GA کچې کې بدلونونه راپور کړي. موږ مخکې ښودلې وه چې نایټریټ د GA ترکیب زیاتولو او په پایله کې، د DELLA34 تخریب له لارې وده هڅوي. په همدې اساس، موږ ولیدل چې د pUBQ10::qmRGA تخمونو کې د هایپوکوټیل اوږدوالی چې د نایټریټ د ډیری عرضه (10 mM NO3−) لاندې کرل شوي د هغو تخمونو په پرتله د پام وړ اوږد و چې د نایټریټ کمښت شرایطو لاندې کرل شوي (ضمیمه انځور 6a). د ودې غبرګون سره سم، د GA سیګنالونه د هغو تخمونو په پرتله چې د نایټریټ په نشتوالي کې کرل شوي د 10 mM NO3− شرایطو لاندې کرل شوي د هایپوکوټیلونو کې لوړ وو (ضمیمه انځور 6b، c). په دې توګه، qmRGA د GA سیګنال کولو کې د بدلونونو څارنه هم فعالوي چې د GA غلظت کې د داخلي بدلونونو له امله رامینځته کیږي.
د دې لپاره چې پوه شو چې ایا د qmRGA لخوا کشف شوي د GA سیګنال کولو فعالیت د GA غلظت او GA درک پورې اړه لري، لکه څنګه چې د سینسر ډیزاین پراساس تمه کیده، موږ په نباتاتي او تولیدي نسجونو کې د دریو GID1 ریسیپټرونو څرګندونه تحلیل کړه. په تخمونو کې، د GID1-GUS راپور ورکوونکي لاین وښودله چې GID1a او c په لوړه کچه په کوټیلډونونو کې څرګند شوي (انځور 3a-c). سربیره پردې، ټول درې ریسیپټرونه په پاڼو، د ریښې پریمورډیا، د ریښې په سرونو (د GID1b د ریښې کیپ پرته)، او د رګونو سیسټم (انځور 3a-c) کې څرګند شوي. د انفلاسیون SAM کې، موږ یوازې د GID1b او 1c لپاره د GUS سیګنالونه وموندل (ضمیمه انځور 7a-c). په سایټ کې هایبرډیزیشن د دې څرګندولو نمونې تایید کړې او نور یې وښودله چې GID1c په SAM کې په ټیټه کچه کې په مساوي ډول څرګند شوی و، پداسې حال کې چې GID1b د SAM په څنډه کې لوړ څرګندونه ښودلې (ضمیمه انځور 7d-l). د pGID1b::2xmTQ2-GID1b ژباړن فیوژن هم د GID1b اظهار یوه درجه بندي شوې لړۍ څرګنده کړه، د SAM په مرکز کې د ټیټ یا هیڅ اظهار څخه د غړو په سرحدونو کې لوړ اظهار پورې (ضمیمه انځور 7m). په دې توګه، د GID1 ریسیپټرونه په نسجونو کې او دننه په مساوي ډول نه ویشل کیږي. په راتلونکو تجربو کې، موږ دا هم ولیدل چې د GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ډیر څرګندونه د هایپوکوټیلونو کې د qmRGA حساسیت د بهرني GA غوښتنلیک ته زیات کړ (انځور 3d، e). برعکس، په هایپوکوټیل کې د qd17mRGA لخوا اندازه شوی فلوروسینس د GA3 درملنې ته غیر حساس و (انځور 3f، g). د دواړو ازموینو لپاره، تخمونه د GA (100 μM GA3) لوړ غلظت سره درملنه شوي ترڅو د سینسر چټک چلند ارزونه وکړي، چیرې چې د GID1 ریسیپټر سره د تړلو وړتیا لوړه شوې یا ورکه شوې وه. په ګډه، دا پایلې تاییدوي چې د qmRGA بایوسینسر د GA او GA سینسر په توګه ګډ فعالیت ترسره کوي، او وړاندیز کوي چې د GID1 ریسیپټر توپیري څرګندونه کولی شي د سینسر اخراج د پام وړ تعدیل کړي.
تر اوسه پورې، په SAM کې د GA سیګنالونو ویش ناڅرګند پاتې دی. له همدې امله، موږ د qmRGA څرګندونکي نباتات او د pCLV3::mCherry-NLS سټیم سیل راپور ورکوونکي 35 څخه کار واخیست ترڅو د GA سیګنال کولو فعالیت لوړ ریزولوشن کمیتي نقشې محاسبه کړو، په L1 طبقه تمرکز وکړو (ایپیډرمیس؛ شکل 4a، b، میتودونه او ضمیمه میتودونه وګورئ)، ځکه چې L1 د SAM ودې کنټرول کې کلیدي رول لوبوي 36. دلته، pCLV3::mCherry-NLS بیان د GA سیګنال کولو فعالیت 37 د ځایي وخت ویش تحلیل لپاره یو ثابت جیومیټریک حواله نقطه چمتو کړه. که څه هم GA د اړخي غړو پراختیا لپاره اړین ګڼل کیږي 4، موږ ولیدل چې د GA سیګنالونه د P3 مرحلې څخه پیل شوي ګل پریمورډیم (P) کې ټیټ وو (انځور 4a، b)، پداسې حال کې چې ځوان P1 او P2 پریمورډیمونه د مرکزي سیمې په څیر منځنۍ فعالیت درلود (انځور 4a، b). د GA لوړ سیګنلینګ فعالیت د عضوي پریمورډیم په سرحدونو کې کشف شو، چې د P1/P2 څخه پیل کیږي (د پولې په اړخونو کې) او په P4 کې لوړیږي، او همدارنګه د پریمورډیا ترمنځ موقعیت لرونکي د پردیو سیمې په ټولو حجرو کې (انځور 4a، b او ضمیمه انځور 8a، b). د GA لوړ سیګنلینګ فعالیت نه یوازې په ایپیډرمیس کې بلکې په L2 او پورتنۍ L3 طبقو کې هم لیدل شوی (ضمیمه انځور 8b). د GA سیګنلینګ نمونه چې په SAM کې د qmRGA په کارولو سره کشف شوې هم د وخت په تیریدو سره بدله پاتې شوه (ضمیمه انځور 8c–f، k). که څه هم د qd17mRGA جوړښت په سیستماتیک ډول د T3 نباتاتو په SAM کې د پنځو خپلواکو لینونو څخه کم شوی و چې موږ یې په تفصیل سره مشخص کړی و، موږ وکولی شو د pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP جوړښت سره ترلاسه شوي فلوروسینس نمونې تحلیل کړو (ضمیمه انځور 8g–j، l). په دې کنټرول لاین کې، په SAM کې د فلوروسینس تناسب کې یوازې کوچني بدلونونه وموندل شول، مګر د SAM مرکز کې موږ د TagBFP سره تړلي VENUS کې یو څرګند او غیر متوقع کمښت ولید. دا تاییدوي چې د qmRGA لخوا لیدل شوی د سیګنال کولو نمونه د mRGA-VENUS د GA پورې تړلي تخریب منعکس کوي، مګر دا هم ښیي چې qmRGA ممکن د مریسټیم مرکز کې د GA سیګنال کولو فعالیت ډیر اټکل کړي. په لنډیز کې، زموږ پایلې د GA سیګنال کولو نمونه څرګندوي چې په عمده توګه د پریمورډیا ویش منعکس کوي. د انټر پریمورډیا سیمې (IPR) دا ویش د پراختیا کونکي پریمورډیا او مرکزي سیمې ترمنځ د لوړ GA سیګنال کولو فعالیت تدریجي تاسیس له امله دی، پداسې حال کې چې په ورته وخت کې په پریمورډیم کې د GA سیګنال کولو فعالیت کمیږي (انځور 4c، d).
د GID1b او GID1c ریسیپټرونو ویش (پورته وګورئ) وړاندیز کوي چې د GA ریسیپټرونو توپیري څرګندونه په SAM کې د GA سیګنال کولو فعالیت نمونې شکل ورکولو کې مرسته کوي. موږ حیران وو چې ایا د GA توپیري راټولیدل ممکن دخیل وي. د دې امکان د څیړلو لپاره، موږ د nlsGPS1 GA FRET سینسر21 څخه کار واخیست. د nlsGPS1 په SAM کې د 10 μM GA4+7 سره د 100 دقیقو لپاره درملنه شوي د فعالولو فریکونسۍ زیاتوالی وموندل شو (ضمیمه انځور 9a–e)، دا په ګوته کوي چې nlsGPS1 په SAM کې د GA غلظت کې بدلونونو ته ځواب ورکوي، لکه څنګه چې دا په ریښو کې کوي21. د nlsGPS1 د فعالولو فریکونسۍ فضايي ویش د SAM په بهرنۍ طبقو کې د GA کچه نسبتا ټیټه ښودلې، مګر ښودلې چې دوی په مرکز او د SAM په سرحدونو کې لوړ شوي (شکل 4e او ضمیمه انځور 9a،c). دا وړاندیز کوي چې GA هم په SAM کې د qmRGA لخوا څرګند شوي د پرتله کولو وړ ځایي نمونې سره ویشل شوی. د بشپړونکي چلند په توګه، موږ د SAM سره د فلوروسینټ GA (GA3-، GA4-، GA7-Fl) یا یوازې Fl سره د منفي کنټرول په توګه چلند وکړ. د Fl سیګنال په ټوله SAM کې توزیع شو، په شمول د مرکزي سیمې او پریمورډیم، که څه هم په ټیټ شدت کې (انځور 4j او ضمیمه انځور 10d). برعکس، ټول درې GA-Fl په ځانګړي ډول د پریمورډیم سرحدونو دننه او د IPR په پاتې برخه کې په مختلفو درجو کې راټول شوي، د GA7-Fl سره د IPR په ترټولو لوی ډومین کې راټول شوي (انځور 4k او ضمیمه انځور 10a، b). د فلوروسینس شدت اندازه کول څرګنده کړه چې د IPR او غیر IPR شدت تناسب د GA-Fl درملنې شوي SAM کې د Fl درملنې شوي SAM په پرتله لوړ و (انځور 4l او ضمیمه انځور 10c). په ګډه، دا پایلې وړاندیز کوي چې GA په IPR حجرو کې په لوړ غلظت کې شتون لري چې د عضوي پولې ته نږدې موقعیت لري. دا وړاندیز کوي چې د SAM GA سیګنال کولو فعالیت نمونه د GA ریسیپټرونو د توپیري اظهار او د عضوي سرحدونو ته نږدې د IPR حجرو کې د GA د توپیري راټولیدو پایله ده. په دې توګه، زموږ تحلیل د GA سیګنال کولو یو غیر متوقع spatiotemporal نمونه څرګنده کړه، د SAM په مرکز او پریمورډیم کې ټیټ فعالیت او په پردیي سیمه کې د IPR کې لوړ فعالیت سره.
په SAM کې د GA د سیګنال کولو د توپیري فعالیت رول د پوهیدو لپاره، موږ د SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS د ریښتیني وخت وخت تیریدو امیجینګ په کارولو سره د GA سیګنال کولو فعالیت، د حجرو پراختیا، او د حجرو ویش ترمنځ اړیکه تحلیل کړه. د ودې تنظیم کې د GA رول ته په پام سره، د حجرو پراختیا پیرامیټرو سره مثبت اړیکه تمه کیده. له همدې امله، موږ لومړی د GA سیګنال کولو فعالیت نقشې د حجرو د سطحې د ودې نرخ نقشو سره پرتله کړې (د ورکړل شوي حجرو لپاره د حجرو پراختیا ځواک لپاره د پراکسي په توګه او د ویش په وخت کې د لور حجرو لپاره) او د ودې انیسوټروپي نقشو سره، کوم چې د حجرو پراختیا سمت اندازه کوي (دلته د ورکړل شوي حجرو لپاره او د ویش په وخت کې د لور حجرو لپاره هم کارول کیږي؛ انځور 5a، b، میتودونه او ضمیمه میتودونه وګورئ). زموږ د SAM د حجرو د سطحې د ودې نرخ نقشې د تیرو مشاهدو سره مطابقت لري 38،39، په سرحد کې د لږترلږه ودې نرخونو او د ودې ګلونو کې د اعظمي ودې نرخونو سره (انځور 5a). د اصلي برخې تحلیل (PCA) ښودلې چې د GA سیګنال کولو فعالیت په منفي ډول د حجرو د سطحې د ودې شدت سره تړاو درلود (شکل 5c). موږ دا هم وښودله چې د تغیر اصلي محورونه، په شمول د GA سیګنال کولو ان پټ او د ودې شدت، د لوړ CLV3 څرګندولو لخوا ټاکل شوي لوري ته اورتوګونل وو، چې په پاتې تحلیلونو کې د SAM مرکز څخه د حجرو جلا کول تاییدوي. د سپیرمین ارتباط تحلیل د PCA پایلې تایید کړې (شکل 5d)، دا په ګوته کوي چې په IPR کې د GA لوړ سیګنالونه د لوړ حجرو پراختیا پایله نه لري. په هرصورت، د ارتباط تحلیل د GA سیګنال کولو فعالیت او د ودې انیسوټروپي (شکل 5c، d) ترمنځ یو څه مثبت اړیکه څرګنده کړه، چې وړاندیز کوي چې په IPR کې د GA لوړ سیګنال د حجرو د ودې لوري او ممکن د حجرو ویش الوتکې موقعیت اغیزه کوي.
a، b د منځنۍ سطحې ودې (a) او ودې انیسوټروپي (b) د تودوخې نقشې په SAM کې په اوسط ډول له اوو خپلواکو نباتاتو څخه ډیرې وې (په ترتیب سره د حجرو د پراختیا د ځواک او لارښوونې لپاره د پراکسي په توګه کارول کیږي). c د PCA تحلیل کې لاندې متغیرات شامل وو: د GA سیګنال، د سطحې ودې شدت، د سطحې ودې انیسوټروپي، او CLV3 څرګندونه. د PCA برخه 1 په عمده توګه د سطحې ودې شدت سره منفي تړاو درلود او په مثبت ډول د GA سیګنال سره تړاو درلود. د PCA برخه 2 په عمده توګه د سطحې ودې انیسوټروپي سره مثبت تړاو درلود او په منفي ډول د CLV3 څرګندونه سره تړاو درلود. سلنه د هر اجزا لخوا تشریح شوي توپیر استازیتوب کوي. d د GA سیګنال، د سطحې ودې شدت، او د سطحې ودې انیسوټروپي ترمنځ د سپیرمین ارتباط تحلیل د نسج پیمانه پرته د CZ. په ښي خوا کې شمیره د دوو متغیرونو ترمنځ د سپیرمین rho ارزښت دی. ستوري هغه قضیې په ګوته کوي چیرې چې اړیکه/منفي اړیکه خورا مهمه ده. e د کنفوکل مایکروسکوپي لخوا د کول-0 SAM L1 حجرو 3D لید. په SAM کې جوړ شوي نوي حجروي دیوالونه (مګر پریمورډیم نه) په 10 h کې د دوی د زاویې ارزښتونو سره سم رنګ شوي دي. د رنګ بار په ښکته ښي کونج کې ښودل شوی. انسیټ په 0 h کې اړونده 3D انځور ښیي. تجربه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوه. f د بکس پلاټونه په IPR او غیر IPR Col-0 SAM (n = 10 خپلواک نباتات) کې د حجرو ویش نرخونه ښیې. د مرکزي کرښې منځنی ښیي، او د بکس حدود 25 او 75 سلنه سلنه ښیي. ویسکرز د R سافټویر سره ټاکل شوي لږترلږه او اعظمي ارزښتونه په ګوته کوي. د P ارزښتونه د ویلچ د دوه لکۍ لرونکي t-ټیسټ سره ترلاسه شوي. g، h سکیماتیک ډیاګرام ښیې (g) د SAM له مرکز څخه د شعاعي لوري په اړه د نوي حجروي دیوال (میجنټا) زاویه څنګه اندازه کړئ (سپینه نقطه شوې کرښه) (یوازې د حاد زاویې ارزښتونه، لکه 0-90°، په پام کې نیول شوي)، او (h) د مریسټیم دننه محیطي/اړخیز او شعاعي لارښوونې. i د SAM (تیاره نیلي)، IPR (منځنی نیلي)، او غیر IPR (روښانه نیلي) په اوږدو کې د حجرو ویش د الوتکې د سمت د فریکونسي هسټوګرامونه په ترتیب سره. د P ارزښتونه د دوه لکۍ لرونکي کولموګوروف-سمیرنوف ازموینې لخوا ترلاسه شوي. تجربه د ورته پایلو سره دوه ځله تکرار شوه. j د P3 (روښانه شنه)، P4 (منځنی شنه)، او P5 (تیاره شنه) شاوخوا د IPR د حجرو ویش د الوتکې د سمت د فریکونسي هسټوګرامونه په ترتیب سره. د P ارزښتونه د دوه لکۍ لرونکي کولموګوروف-سمیرنوف ازموینې لخوا ترلاسه شوي. تجربه د ورته پایلو سره دوه ځله تکرار شوه.
له همدې امله، موږ بیا د GA سیګنالینګ او د حجرو ویش فعالیت ترمنځ اړیکه د ارزونې په جریان کې د نوي جوړ شوي حجرو دیوالونو په پیژندلو سره وڅیړله (انځور 5e). دې طریقې موږ ته اجازه راکړه چې د حجرو ویش فریکونسي او سمت اندازه کړو. په حیرانتیا سره، موږ وموندله چې د IPR او د SAM پاتې برخې (غیر IPR، شکل 5f) کې د حجرو ویش فریکونسي ورته وه، دا په ګوته کوي چې د IPR او غیر IPR حجرو ترمنځ د GA سیګنالینګ کې توپیرونه د حجرو ویش باندې د پام وړ اغیزه نه کوي. دا، او د GA سیګنالینګ او ودې انیسوټروپي ترمنځ مثبت اړیکه، موږ دې ته وهڅول چې په پام کې ونیسو چې ایا د GA سیګنالینګ فعالیت کولی شي د حجرو ویش الوتکې سمت اغیزه وکړي. موږ د نوي حجروي دیوال موقعیت د حاد زاویې په توګه اندازه کړ چې د ریډیل محور سره تړاو لري چې د مریسټیم مرکز او د نوي حجروي دیوال مرکز سره نښلوي (شکل 5e-i) او د حجرو لپاره د 90 درجو په نږدې زاویو کې د ویشلو لپاره یو روښانه تمایل ولیدل چې د ریډیل محور سره تړاو لري، د لوړې فریکونسۍ سره چې په 70-80° (23.28%) او 80-90° (22.62%) (شکل 5e,i) کې لیدل شوي، د محیطي/مترقي لوري کې د حجرو ویش سره مطابقت لري (شکل 5h). د دې حجروي ویش چلند ته د GA سیګنالینګ ونډې معاینه کولو لپاره، موږ په جلا توګه د IPR او غیر IPR کې د حجرو ویش پیرامیټرې تحلیل کړې (شکل 5i). موږ ولیدل چې د IPR حجرو کې د ویش زاویه ویش د غیر IPR حجرو یا په ټول SAM کې د حجرو څخه توپیر درلود، د IPR حجرو سره د جانبي/سرکلر حجرو ویشونو لوړ تناسب ښودلی، د بیلګې په توګه، 70-80° او 80-90° (په ترتیب سره 33.86% او 30.71%، اړونده تناسب) (انځور 5i). په دې توګه، زموږ مشاهدو د لوړ GA سیګنالینګ او د حجرو ویش الوتکې سمت ترمنځ اړیکه څرګنده کړه چې محیطي لوري ته نږدې ده، د GA سیګنالینګ فعالیت او ودې انیسوټروپي (انځور 5c، d) ترمنځ اړیکې ته ورته. د دې اتحادیې د فضايي ساتنې نور هم رامینځته کولو لپاره، موږ د P3 څخه پیل شوي پریمورډیم شاوخوا IPR حجرو کې د ویش الوتکې سمت اندازه کړ، ځکه چې د P4 څخه پیل شوي پدې سیمه کې د GA سیګنالینګ ترټولو لوړ فعالیت کشف شو (انځور 4). د P3 او P4 شاوخوا د IPR ویش زاویو هیڅ احصایوي مهم توپیرونه نه دي ښودلي، که څه هم د جانبي حجرو ویشونو زیاتوالی فریکونسي په IPR کې د P4 شاوخوا IPR کې لیدل شوې (انځور 5j). په هرصورت، د P5 شاوخوا IPR حجرو کې، د حجرو ویش الوتکې د سمت توپیر په احصایوي ډول د پام وړ شو، د انتقالي حجرو ویشونو فریکونسۍ کې د تیز زیاتوالي سره (انځور 5j). په ګډه، دا پایلې وړاندیز کوي چې د GA سیګنالینګ کولی شي په SAM کې د حجرو ویشونو سمت کنټرول کړي، کوم چې د پخوانیو راپورونو سره مطابقت لري40,41 چې د GA لوړ سیګنالینګ کولی شي په IPR کې د حجرو ویشونو اړخیز سمت رامینځته کړي.
وړاندوینه کیږي چې په IPR کې حجرات به په پریمورډیا کې نه بلکې په انټرنوډونو کې شامل شي 2,42,43. په IPR کې د حجرو ویشونو ټرانسورس سمت ممکن په انټرنوډونو کې د ایپیډرمل حجرو د موازي طول البلد قطارونو د ځانګړي تنظیم پایله ولري. زموږ مشاهدې چې پورته تشریح شوي وړاندیز کوي چې د GA سیګنالینګ احتمال لري د حجرو ویش سمت تنظیم کولو سره پدې پروسه کې رول ولوبوي.
د څو DELLA جینونو د فعالیت له لاسه ورکول د GA غبرګون رامینځته کوي، او د ډیلا میوټینټونه د دې فرضیې ازموینې لپاره کارول کیدی شي44. موږ لومړی په SAM کې د پنځو DELLA جینونو د څرګندولو نمونې تحلیل کړې. د GUS لاین45 د نقل کولو فیوژن څرګنده کړه چې GAI، RGA، RGL1، او RGL2 (تر ډیره حده پورې) په SAM کې څرګند شوي (ضمیمه انځور 11a–d). په سایټو هایبرډیزیشن نور هم وښودله چې GAI mRNA په ځانګړي ډول په پریمورډیا او وده کونکي ګلونو کې راټولیږي (ضمیمه انځور 11e). RGL1 او RGL3 mRNA د SAM کینوپی او زړو ګلونو کې کشف شوي، پداسې حال کې چې RGL2 mRNA په سرحدي سیمه کې ډیر زیات و (ضمیمه انځور 11f–h). د pRGL3::RGL3-GFP SAM کنفوکل امیجنگ د سایټو هایبرډیزیشن لخوا لیدل شوي څرګندونه تایید کړه او وښودله چې RGL3 پروټین د SAM په مرکزي برخه کې راټولیږي (ضمیمه انځور 11i). د pRGA::GFP-RGA کرښې په کارولو سره، موږ دا هم وموندله چې د RGA پروټین په SAM کې راټولیږي، مګر د هغې کثرت د P4 څخه پیل شوي سرحد کې کمیږي (ضمیمه انځور 11j). د پام وړ، د RGL3 او RGA د بیان نمونې په IPR کې د لوړ GA سیګنلینګ فعالیت سره مطابقت لري، لکه څنګه چې د qmRGA لخوا کشف شوی (شکل 4). سربیره پردې، دا معلومات ښیي چې ټول DELLAs په SAM کې څرګند شوي او د دوی څرګندونه په ټولیز ډول ټول SAM پراخوي.
موږ بیا د وحشي ډول SAM (Ler، کنټرول) او gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (شکل 6a، b) کې د حجرو ویش پیرامیټرونه تحلیل کړل. په زړه پورې خبره دا ده چې موږ د وحشي ډول (شکل 6c) په پرتله په ډیلا ګلوبل mutant SAM کې د حجرو ویش زاویه فریکونسیو ویش کې د احصایوي پلوه د پام وړ بدلون ولید. د ډیلا ګلوبل mutant کې دا بدلون د 80-90° زاویو (34.71% vs. 24.55%) او په لږ حد پورې، 70-80° زاویو (23.78% vs. 20.18%) د فریکونسی زیاتوالي له امله و، یعنې، د انتقالي حجرو ویشونو سره مطابقت لري (شکل 6c). د غیر انتقالي ویشونو فریکونسی (0-60°) هم په ډیلا ګلوبل mutant (شکل 6c) کې ټیټ و. د ډیلا ګلوبل میوټینټ (انځور 6b) په SAM کې د ټرانسورس حجرو ویشونو فریکونسي د پام وړ لوړه شوې وه. په IPR کې د ټرانسورس حجرو ویشونو فریکونسي هم د وحشي ډول (انځور 6d) په پرتله په ډیلا ګلوبل میوټینټ کې لوړه وه. د IPR سیمې څخه بهر، وحشي ډول د حجرو ویش زاویو ډیر یونیفورم ویش درلود، پداسې حال کې چې ډیلا ګلوبل میوټینټ د IPR (انځور 6e) په څیر تنګی ویش غوره کړ. موږ د ga2 اکسیډیز (ga2ox) کوینټوپل میوټینټونو (ga2ox1-1، ga2ox2-1، ga2ox3-1، ga2ox4-1، او ga2ox6-2) په SAM کې د حجرو ویشونو سمت هم اندازه کړ، د GA غیر فعال میوټینټ شالید چې GA پکې راټولیږي. د GA کچې د زیاتوالي سره سم، د quintuple ga2ox mutant inflorescence SAM د Col-0 په پرتله لوی و (ضمیمه انځور 12a، b)، او د Col-0 په پرتله، quintuple ga2ox SAM د حجرو ویش زاویو یو څرګند توپیر ښودلی، د زاویې فریکونسي له 50° څخه تر 90° پورې لوړه شوې، یعنې بیا د تنجیتي ویشونو ملاتړ کوي (ضمیمه انځور 12a-c). په دې توګه، موږ ښیو چې د GA سیګنال کولو اساسي فعالول او د GA راټولول په IPR او د SAM پاتې برخې کې د جانبي حجرو ویش هڅوي.
a، b د PI-stained Ler (a) او global della mutant (b) SAM د L1 طبقې 3D لید د کنفوکال مایکروسکوپي په کارولو سره. د 10 ساعتونو په موده کې په SAM (مګر پریمورډیم نه) کې جوړ شوي نوي حجروي دیوالونه د دوی د زاویې ارزښتونو سره سم ښودل شوي او رنګ شوي دي. انسیټ په 0 ساعتونو کې SAM ښیې. د رنګ بار په ښکته ښي کونج کې ښودل شوی. په (b) کې تیر د نړیوال della mutant کې د سمون شوي حجروي فایلونو مثال ته اشاره کوي. تجربه د ورته پایلو سره دوه ځله تکرار شوه. ce د Ler او global della ترمنځ په ټول SAM (d)، IPR (e)، او غیر IPR (f) کې د حجروي ویش الوتکې سمتونو د فریکونسي ویش پرتله کول. د P ارزښتونه د دوه لکۍ لرونکي کولموګوروف-سمیرنوف ازموینې په کارولو سره ترلاسه شوي. f، g د Col-0 (i) او pCUC2::gai-1-VENUS (j) ټرانسجینک نباتاتو د PI-stained SAM د کنفوکال عکسونو 3D لید. پینلونه (a، b) د 10 ساعتونو دننه په SAM کې جوړ شوي نوي حجروي دیوالونه (مګر پریمورډیا نه) ښیي. تجربه دوه ځله د ورته پایلو سره تکرار شوه. h–j د ټول SAM (h)، IPR (i) او غیر IPR (j) کې د Col-0 او pCUC2::gai-1-VENUS نباتاتو ترمنځ د حجروي ویش الوتکې سمتونو د فریکونسي ویش پرتله کول. د P ارزښتونه د دوه لکۍ لرونکي کولموګوروف – سمیرنوف ازموینې په کارولو سره ترلاسه شوي.
موږ بیا د GA سیګنالینګ د مخنیوي اغیز په ځانګړي ډول په IPR کې ازموینه وکړه. د دې هدف لپاره، موږ د کوټیلډون کپ 2 (CUC2) پروموټر وکاروو ترڅو د غالب منفي gai-1 پروټین څرګندونه چې VENUS سره یوځای شوي (په pCUC2::gai-1-VENUS لاین کې). په وحشي ډول SAM کې، CUC2 پروموټر په SAM کې د ډیری IPRs څرګندونه چلوي، په شمول د سرحدي حجرو، د P4 څخه، او ورته ځانګړي څرګندونه په pCUC2::gai-1-VENUS نباتاتو کې لیدل شوې (لاندې وګورئ). د pCUC2::gai-1-VENUS نباتاتو د SAM یا IPR په اوږدو کې د حجرو ویش زاویو ویش د وحشي ډول څخه د پام وړ توپیر نه درلود، که څه هم موږ په ناڅاپي ډول وموندله چې په دې نباتاتو کې د IPR پرته حجرې د 80-90° لوړ فریکونسۍ سره ویشل شوي (انځور 6f-j).
دا وړاندیز شوی چې د حجرو ویش لوري د SAM په جیومیټري پورې اړه لري، په ځانګړې توګه د نسجونو د منحني له امله رامینځته شوي کششي فشار 46. له همدې امله موږ وپوښتل چې ایا د SAM شکل د ډیلا ګلوبل میوټینټ او pCUC2::gai-1-VENUS نباتاتو کې بدل شوی. لکه څنګه چې مخکې راپور ورکړل شوی 12، د ډیلا ګلوبل میوټینټ SAM اندازه د وحشي ډول څخه لویه وه (ضمیمه انځور 13a، b، d). د CLV3 او STM RNA په سایټو هایبرډیزیشن د ډیلا میوټینټونو کې د میرسټیم پراختیا تایید کړه او د سټیم حجرو طاق اړخ پراختیا یې نوره هم وښودله (ضمیمه انځور 13e، f، h، i). په هرصورت، د SAM منحني په دواړو جینټایپونو کې ورته وه (ضمیمه انځور 13k، m، n، p). موږ د gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant په اندازه کې ورته زیاتوالی ولید پرته له دې چې د وحشي ډول په پرتله په منحني کې بدلون راشي (ضمیمه انځور 13c، d، g، j، l، o، p). د حجرو د ویش د سمت فریکونسي په ډیلا کواډروپل میوټینټ کې هم اغیزمنه شوه، مګر د ډیلا مونولیتیک میوټینټ په پرتله لږ حد پورې (ضمیمه انځور 12d-f). دا دوز اغیز، د منحني باندې د اغیزې نشتوالي سره، وړاندیز کوي چې د ډیلا کواډروپل میوټینټ کې د RGL3 پاتې فعالیت د DELLA فعالیت له لاسه ورکولو له امله د حجرو د ویش په سمت کې بدلونونه محدودوي او دا چې د جانبي حجرو ویش کې بدلونونه د SAM جیومیټري کې د بدلونونو پرځای د GA سیګنالینګ فعالیت کې د بدلونونو په ځواب کې پیښیږي. لکه څنګه چې پورته تشریح شوي، د CUC2 پروموټر په SAM کې د IPR څرګندونه چلوي چې د P4 څخه پیل کیږي (ضمیمه انځور 14a، b)، او په برعکس، د pCUC2::gai-1-VENUS SAM اندازه کمه وه مګر لوړه منحنی وه (ضمیمه انځور 14c–h). د pCUC2::gai-1-VENUS SAM مورفولوژي کې دا بدلون ممکن د وحشي ډول په پرتله د میخانیکي فشارونو مختلف ویش پایله ولري، په کوم کې چې لوړ محیطي فشارونه د SAM مرکز څخه په لنډ واټن کې پیل کیږي 47. په بدیل سره، د pCUC2::gai-1-VENUS SAM مورفولوژي کې بدلونونه ممکن د سیمه ایز میخانیکي ملکیتونو کې د بدلونونو پایله وي چې د ټرانسجین اظهار لخوا رامینځته کیږي 48. په دواړو حالتونو کې، دا کولی شي د GA سیګنالینګ کې د بدلونونو اغیزې په جزوي ډول د دې احتمال زیاتولو سره چې حجرې به په محیطي/ټرانسورس سمت کې ویشل شي، زموږ مشاهدې تشریح کوي.
په ګډه سره، زموږ معلومات تاییدوي چې د GA لوړ سیګنالینګ په IPR کې د حجرو ویش الوتکې د اړخ لوري په سمت کې فعال رول لوبوي. دوی دا هم ښیي چې د میرستیم منحنی هم په IPR کې د حجرو ویش الوتکې سمت اغیزه کوي.
د IPR کې د ویش الوتکې ټرانسورس سمت، د GA د لوړ سیګنال کولو فعالیت له امله، وړاندیز کوي چې GA د SAM دننه په ایپیډرمیس کې د ریډیل حجرو فایل دمخه تنظیموي ترڅو هغه حجروي سازمان تعریف کړي چې وروسته به د ایپیډرمل انټرنوډ کې وموندل شي. په حقیقت کې، دا ډول حجروي فایلونه په مکرر ډول د ډیلا ګلوبل میوټینټونو (شکل 6b) SAM عکسونو کې لیدل کیده. په دې توګه، په SAM کې د GA سیګنال کولو د فضايي نمونې د پراختیایي فعالیت د نور سپړلو لپاره، موږ د وخت تیریدو امیجنگ څخه کار واخیست ترڅو په IPR کې د وحشي ډول (Ler او Col-0)، ډیلا ګلوبل میوټینټونو، او pCUC2::gai-1-VENUS ټرانسجینک نباتاتو کې د حجرو فضايي تنظیم تحلیل کړو.
موږ وموندله چې qmRGA ښودلې چې په IPR کې د GA سیګنال کولو فعالیت د P1/P2 څخه زیات شوی او P4 ته رسیدلی، او دا نمونه د وخت په تیریدو سره ثابت پاتې شوې (انځور 4a–f او ضمیمه انځور 8c–f، k). د GA سیګنال د زیاتوالي سره په IPR کې د حجرو د فضايي تنظیم تحلیل کولو لپاره، موږ د لومړي مشاهدې وروسته 34 ساعته تحلیل شوي د دوی د پراختیا برخلیک سره سم د Ler IPR حجرې پورته او د P4 اړخونو ته لیبل کړې، د بیلګې په توګه، د دوه څخه ډیر پلاستیډ وختونه، موږ ته اجازه راکوي چې د P1/P2 څخه تر P4 پورې د پریمورډیم پراختیا په جریان کې د IPR حجرې تعقیب کړو. موږ درې مختلف رنګونه وکارول: ژیړ د هغو حجرو لپاره چې د P4 سره نږدې پریمورډیم کې مدغم شوي وو، شنه د هغو لپاره چې په IPR کې وو، او ارغواني د هغو لپاره چې په دواړو پروسو کې یې برخه اخیستې وه (انځور 7a–c). په t0 (0 h) کې، د IPR حجرو 1-2 طبقې د P4 مخې ته لیدل کیدې (انځور 7a). لکه څنګه چې تمه کېده، کله چې دا حجرات ووېشل شول، نو دوی په عمده توګه د ټرانسورس ویش الوتکې له لارې دا کار وکړ (انځورونه 7a–c). ورته پایلې د Col-0 SAM په کارولو سره ترلاسه شوې (په P3 تمرکز کوي، چې پوله یې په Ler کې P4 ته ورته پوښل کیږي)، که څه هم پدې جینټایپ کې د ګلونو په پوله کې جوړ شوی فولډ د IPR حجرات ډیر ژر پټ کړل (انځور 7g–i). په دې توګه، د IPR حجرو د ویش نمونه حجرات په ریډیل قطارونو کې مخکې له مخکې تنظیموي، لکه څنګه چې په انټرنوډونو کې. د ریډیل قطارونو تنظیم او د پرله پسې ارګانونو ترمنځ د IPR حجرو ځایی کول وړاندیز کوي چې دا حجرات انټرنوډل پروجینیټرونه دي.
دلته، موږ د تناسب متریک GA سیګنلینګ بایوسینسر، qmRGA رامینځته کړی، چې د GA سیګنلینګ فعالیت کمیتي نقشه کولو ته اجازه ورکوي چې د ګډ GA او GA ریسیپټر غلظت څخه رامینځته کیږي پداسې حال کې چې د داخلي سیګنلینګ لارو سره مداخله کموي، پدې توګه د حجروي کچې په کچه د GA فعالیت په اړه معلومات چمتو کوي. د دې هدف لپاره، موږ یو تعدیل شوی DELLA پروټین، mRGA جوړ کړ، چې د DELLA تعامل شریکانو سره د تړلو وړتیا یې له لاسه ورکړې مګر د GA هڅول شوي پروټولیسس سره حساس پاتې کیږي. qmRGA د GA په کچه کې د خارجي او داخلي بدلونونو دواړو ته ځواب ورکوي، او د هغې متحرک سینسنګ ملکیتونه د پراختیا په جریان کې د GA سیګنلینګ فعالیت کې د ځایي وخت بدلونونو ارزونه فعالوي. qmRGA هم یو ډیر انعطاف منونکی وسیله ده ځکه چې دا د هغې د څرګندولو لپاره کارول شوي پروموټر بدلولو سره مختلف نسجونو سره تطابق کیدی شي (که اړتیا وي)، او د GA سیګنلینګ لارې خوندي طبیعت او د انجیوسپرمونو په اوږدو کې د PFYRE شکل ته په پام سره، دا احتمال لري چې نورو ډولونو ته د لیږد وړ وي 22. د دې سره سم، د وریجو SLR1 DELLA پروټین (HYY497AAA) کې یو مساوي بدلون هم ښودل شوی چې د SLR1 د ودې فشارونکي فعالیت فشاروي پداسې حال کې چې یوازې د GA-منځګړیتوب تخریب یو څه کموي، د mRGA23 په څیر. د پام وړ، په Arabidopsis کې وروستیو مطالعاتو ښودلې چې په PFYRE ډومین (S474L) کې یو واحد امینو اسید بدلون د RGA د لیږد فعالیت بدل کړ پرته لدې چې د لیږد فکتور شریکانو سره د تعامل کولو وړتیا اغیزه وکړي50. که څه هم دا بدلون په mRGA کې موجود 3 امینو اسید بدیلونو ته خورا نږدې دی، زموږ مطالعات ښیې چې دا دوه بدلونونه د DELLA ځانګړي ځانګړتیاوې بدلوي. که څه هم ډیری د لیږد فکتور شریکان د DELLA26,51 LHR1 او SAW ډومینونو سره تړلي دي، په PFYRE ډومین کې ځینې ساتل شوي امینو اسیدونه ممکن د دې تعاملاتو ثبات کې مرسته وکړي.
د انټرنوډ پراختیا د نباتاتو په جوړښت او د حاصلاتو په ښه والي کې یو مهم ځانګړتیا ده. qmRGA د IPR انټرنوډ پروجینیټر حجرو کې د GA لوړ سیګنلینګ فعالیت څرګند کړ. د کمیتي عکس العمل او جینیات سره یوځای کولو سره، موږ وښودله چې د GA سیګنلینګ نمونې په SAM ایپیډرمیس کې د سرکلر / ټرانسورس حجرو ویش پلینونه سپر امپوز کوي، د انټرنوډ پراختیا لپاره اړین د حجرو ویش تنظیم جوړوي. د پراختیا په جریان کې د حجرو ویش پلین سمت ډیری تنظیم کونکي پیژندل شوي 52,53. زموږ کار د دې روښانه مثال وړاندې کوي چې څنګه د GA سیګنلینګ فعالیت دا سیلولر پیرامیټر تنظیموي. DELLA کولی شي د پریفولډینګ پروټین کمپلیکسونو سره تعامل وکړي 41، نو د GA سیګنلینګ ممکن د کورټیکل مایکروټیوبیل سمت مستقیم اغیزه کولو سره د حجرو ویش پلین سمت تنظیم کړي 40,41,54,55. موږ په ناڅاپي ډول وښودله چې په SAM کې، د لوړ GA سیګنلینګ فعالیت ارتباط د حجرو اوږدوالی یا ویش نه و، مګر یوازې د ودې انیسوټروپي وه، کوم چې د IPR کې د حجرو ویش په لور د GA مستقیم اغیز سره مطابقت لري. په هرصورت، موږ دا نه شو ردولی چې دا اغیزه هم غیر مستقیم کیدی شي، د بیلګې په توګه د GA- هڅول شوي حجروي دیوال نرمولو لخوا منځګړیتوب 56. د حجروي دیوال په ځانګړتیاو کې بدلونونه میخانیکي فشار رامینځته کوي 57,58، کوم چې کولی شي د حجروي ویش الوتکې سمت هم د کورټیکل مایکروټیوبلز سمت اغیزه کولو سره اغیزه وکړي 39,46,59. د GA- هڅول شوي میخانیکي فشار او د GA لخوا د مایکروټیوبیل سمت مستقیم تنظیم ګډ اغیزې ممکن د انټرنوډونو تعریف کولو لپاره په IPR کې د حجروي ویش سمت یو ځانګړی نمونه رامینځته کولو کې دخیل وي، او د دې مفکورې ازموینې لپاره نورو مطالعاتو ته اړتیا ده. په ورته ډول، پخوانیو مطالعاتو د انټرنوډ جوړښت کنټرول کې د DELLA- متقابل پروټینونو TCP14 او 15 اهمیت روښانه کړی 60,61 او دا عوامل ممکن د BREVIPEDICELLUS (BP) او PENNYWISE (PNY) سره یوځای د GA عمل منځګړیتوب وکړي، کوم چې د انټرنوډ پراختیا تنظیموي او ښودل شوي چې د GA سیګنالینګ اغیزه کوي 2,62. دې ته په پام سره چې DELLAs د براسینوسټرایډ، ایتیلین، جیسمونیک اسید، او ابسیسیک اسید (ABA) سیګنالینګ لارو سره تعامل کوي 63,64 او دا هورمونونه کولی شي د مایکروټیوبیل سمت اغیزه وکړي 65، د GA اغیزې د حجرو ویش سمت باندې هم ممکن د نورو هورمونونو لخوا منځګړیتوب شي.
د سایتولوژیکي لومړنیو مطالعاتو ښودلې چې د Arabidopsis SAM داخلي او بهرنۍ سیمې دواړه د انټرنوډ پراختیا لپاره اړین دي 2,42. دا حقیقت چې GA په فعاله توګه په داخلي نسجونو کې د حجرو ویش تنظیموي 12 د SAM کې د مریسټیم او انټرنوډ اندازې تنظیم کولو کې د GA دوه ګونی فعالیت ملاتړ کوي. د سمتي حجرو ویش نمونه هم په داخلي SAM نسج کې په کلکه تنظیم شوې، او دا تنظیم د ډډ ودې لپاره اړین دی 52. دا به په زړه پورې وي چې معاینه شي چې ایا GA د داخلي SAM سازمان کې د حجرو ویش الوتکې په سمت کولو کې هم رول لوبوي، په دې توګه د SAM دننه د انټرنوډونو مشخصات او پراختیا همغږي کوي.
نباتات په خاوره کې په ان ویټرو کې کرل شوي یا 1x موراشیګ-سکوګ (MS) میډیم (Duchefa) د معیاري شرایطو لاندې د 1٪ سوکروز او 1٪ اګر (Sigma) سره ضمیمه شوي (16 ساعته رڼا، 22 °C)، پرته له هایپوکوټیل او ریښو ودې تجربو څخه چې تخمونه په عمودی پلیټونو کې د دوامداره رڼا او 22 °C لاندې کرل شوي. د نایټریټ تجربو لپاره، نباتات په تعدیل شوي MS میډیم (bioWORLD نبات میډیم) کې کرل شوي چې د کافي نایټریټ (0 یا 10 mM KNO3)، 0.5 mM NH4-succinate، 1٪ سوکروز او 1٪ A-agar (Sigma) سره د اوږدې ورځې شرایطو لاندې ضمیمه شوي.
په pDONR221 کې داخل شوی GID1a cDNA د pDONR P4-P1R-pUBQ10 او pDONR P2R-P3-mCherry سره pB7m34GW ته بیا یوځای شو ترڅو pUBQ10::GID1a-mCherry تولید کړي. په pDONR221 کې داخل شوی IDD2 DNA د pB7RWG266 ته بیا یوځای شو ترڅو p35S:IDD2-RFP تولید کړي. د pGID1b::2xmTQ2-GID1b د تولید لپاره، د GID1b کوډینګ سیمې څخه پورته 3.9 kb ټوټه او د GID1b cDNA (1.3 kb) او ټرمینیټر (3.4 kb) لرونکی 4.7 kb ټوټه لومړی د ضمیمه جدول 3 کې د پرائمرونو په کارولو سره پراخه شوه او بیا په ترتیب سره pDONR P4-P1R (ترمو فشر ساینسي) او pDONR P2R-P3 (ترمو فشر ساینسي) کې داخل شوه، او په پای کې د ګیټ وے کلونینګ په کارولو سره د pDONR221 2xmTQ268 سره د pGreen 012567 هدف ویکتور کې بیا یوځای شوه. د pCUC2::LSSmOrange د تولید لپاره، د CUC2 پروموټر ترتیب (د ATG پورته 3229 bp) وروسته د لوی سټوکس-شفټ شوي mOrange (LSSmOrange)69 د کوډ کولو ترتیب د N7 اټومي ځایی کولو سیګنال او NOS ټرانسکرپشنل ټرمینیټر سره د ګیټ وے 3-ټوټې بیا ترکیب سیسټم (انویټروجن) په کارولو سره د pGreen kanamycin په نښه کولو ویکتور کې راټول شو. د نبات بائنری ویکتور د Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ته معرفي شو او په ترتیب سره د Agrobacterium infiltration میتود لخوا د Nicotiana benthamiana پاڼو ته او د ګلونو ډوب میتود لخوا Arabidopsis thaliana Col-0 ته معرفي شو. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry او pCLV3::mCherry-NLS qmRGA په ترتیب سره د اړوندو صلیبونو F3 او F1 اولادونو څخه جلا شول.
د RNA in situ hybridization په نږدې 1 سانتي متره اوږد شوټ ټیپونو باندې ترسره شو72، کوم چې راټول شوي او سمدلاسه د FAA محلول (3.7٪ formaldehyde، 5٪ acetic acid، 50٪ ethanol) کې تنظیم شوي چې مخکې له مخکې 4 °C ته سړه شوي وو. د 2 × 15 دقیقو ویکیوم درملنې وروسته، فکسیټیو بدل شو او نمونې د شپې لپاره انکیوبیټ شوې. GID1a، GID1b، GID1c، GAI، RGL1، RGL2، او RGL3 cDNAs او د دوی 3′-UTRs ته انټي سینس پروبونه د ضمیمه جدول 3 کې ښودل شوي پرائمرونو په کارولو سره ترکیب شوي لکه څنګه چې د Rosier et al.73 لخوا تشریح شوي. د ډیګاکسیجنین لیبل شوي پروبونه د ډیګاکسیجنین انټي باډیز (۳۰۰۰ ځله حل کول؛ روش، د کتلاګ شمیره: ۱۱ ۰۹۳ ۲۷۴ ۹۱۰) په کارولو سره معافیت کشف شول، او برخې یې د ۵-برومو-۴-کلورو-۳-انډولیل فاسفیټ (BCIP، ۲۵۰ ځله حل کول)/نایتروبلو ټیټرازولیم (NBT، ۲۰۰ ځله حل کول) محلول سره رنګ شوي.